第五章分子生物學(xué)研究法()核酸技術(shù)

第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

核酸的凝膠電泳p.173

1)基本原理:

在生理?xiàng)l件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)是呈離子化狀態(tài),所以DNA和RNA多核苷酸鏈?zhǔn)菐ж?fù)電的,把這些核酸分子放置在電場(chǎng)中,它們就會(huì)向正電極的方向移動(dòng)。

遷移:核酸分子在電場(chǎng)中的移動(dòng)。

電泳的遷移率:核酸分子在電場(chǎng)中的遷移速度。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下,遷移率取決于核酸分子本身的大小和形狀(超螺旋結(jié)構(gòu)、開環(huán)、線性的DNA）。

這就是應(yīng)用凝膠技術(shù)分離DNA片段的基本原理。

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2)瓊脂糖/聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)-瓊脂糖是一種線性多糖聚合物,將瓊脂糖加熱到熔點(diǎn)后冷卻凝固便會(huì)形成帶有孔隙的電泳介質(zhì),其孔隙的大小和膠的濃度有關(guān),濃度越高,孔隙越小,其分辨能力越強(qiáng),反之則越弱。

-聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)劑在催化劑(如過硫酸銨)作用下形成的凝膠。-瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍是:0.2–50kb之間;聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段范圍是:1-1000bp之間。

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表:瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力___________________________________________________凝膠類型及濃度分離DNA片段的范圍(bp)___________________________________________________0.3%瓊脂糖50000-10000.7%瓊脂糖20000-10001.4%瓊脂糖6000-3002%瓊脂糖3004%聚丙烯酰胺1000-10010%聚丙烯酰胺500-2520%聚丙烯酰胺50-1___________________________________________________本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

3）核酸染色與檢測(cè)染色劑：溴化乙錠(

ethidiumbromide,簡(jiǎn)稱EtBr)

它的分子呈扁平狀，可以插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間；在紫外光照射下,它呈現(xiàn)出桔黃色熒光,熒光強(qiáng)度與DNA片段的大小(或數(shù)量)成正比。

嵌入的EtBr分子EtBr正常DNA雙鏈嵌入了EtBr的DNA雙鏈圖:溴化乙錠對(duì)DNA分子的插入作用本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

（1）染色方法

在熔膠冷卻到~50℃時(shí),將EtBr加入膠中,當(dāng)DNA分子在凝膠介質(zhì)中移動(dòng)時(shí)能夠吸收EtBr,但EtBr不能與凝膠介質(zhì)相結(jié)合,多余的EtBr則進(jìn)入到電泳緩沖液中。

把含有DNA分子的凝膠膠板浸泡在EtBr溶液中片刻,然后將膠取出,并放置在紫外光下進(jìn)行觀察。（2）檢測(cè)將染色凝膠放置在紫外光下觀察,即可檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA帶位置。如果在加樣時(shí),其中一個(gè)樣品槽中加入DNA標(biāo)記物，通過與標(biāo)準(zhǔn)DNA的譜帶位置相比較,便可推測(cè)出目的DNA片段的大小,同時(shí)還可以估計(jì)出DNA的濃度。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

質(zhì)粒DNA酶切驗(yàn)證圖譜本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

-GoldViewI型核酸染色劑是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型DNA染料，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外燈下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈紅色熒光。

SuperGreenI型核酸染色劑

GeneFinder核酸染色劑

溴化乙錠的無毒代替物：本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

4）脈沖電場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)p.174圖5-6

適用于分離50kb以上的DNA超大片段。

原理:在脈沖式交變電場(chǎng)中,DNA分子的遷移方向隨著電場(chǎng)方向的周期變化而不斷改變。在標(biāo)準(zhǔn)的PFGE中,第一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向成45°夾角,而第二個(gè)脈沖的場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成45°夾角,由于凝膠質(zhì)的電場(chǎng)方向的變化,使得DNA分子能夠隨時(shí)調(diào)整其移動(dòng)方向，以適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

圖:在脈沖凝膠電泳中的等高壓均勻電場(chǎng)獲得的染色體DNA電泳圖譜

家蠶病原白僵菌至少有6條染色體,估算其大小在2.5～7.2Mbp之間,3種分離菌株間存在多型性。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

2.核酸的分子雜交

就是將待測(cè)定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA與探針混合，如果DNA或RNA片段中含有與探針互補(bǔ)的序列,那么其相應(yīng)的同源區(qū)段就會(huì)形成雙鏈結(jié)構(gòu),反之。

探針:是指經(jīng)過特殊化合物標(biāo)記的特定的核苷酸序列。

-DNA分子雜交（DNA印跡雜交,Southernblotting)

-RNA分子雜交(RNA印跡雜交

,Northernblotting)

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1）DNA分子雜交技術(shù)-Southernblotting

用于檢測(cè)DNA片段中是否存在與探針同源的序列

因此，可以用于分析外源基因在宿主染色體DNA中的整合等情況。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分12345CKSouthernbloting本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

（1）DNA印跡雜交原理-基因組DNA的限制性酶切及片段的瓊脂糖凝膠電泳分離-堿處理使待測(cè)定的DNA片段變性-固定在濾膜表面（轉(zhuǎn)膜）-加入經(jīng)標(biāo)記的單鏈探針進(jìn)行雜交-如果待測(cè)定的DNA片段存在與探針同源的序列,他們可通過堿基互補(bǔ)作用形成雙鏈,根據(jù)探針標(biāo)記物的特性對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

（2）濾膜的種類及選擇濾膜必須具備如下特點(diǎn):能很好地與DNA(RNA)分子結(jié)合不影響DNA片段與探針雜交對(duì)探針及其他物質(zhì)的非特異性吸附力小具有良好的機(jī)械性常用濾膜有:硝酸纖維素膜只能與單鏈DNA/RNA在高鹽條件下結(jié)合,膜與DNA片段以疏水性結(jié)合,烘干后結(jié)合能力強(qiáng)。但不適于電轉(zhuǎn)移法；對(duì)小于200bp的片段結(jié)合力差；膜不可重復(fù)使用。尼龍膜*二乙氨基乙基纖維素濾膜本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

（3）DNA探針的種類放射性(32P)和非放射性探針均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針

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-非放射性標(biāo)記物生物素(biotin):是一種水溶性B族維生素,又稱維生素H。

特點(diǎn)：既能與核苷酸、核酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)又可與抗生物素蛋白/抗體等結(jié)合偶聯(lián)反應(yīng)：是通過生物素與dUTP分子中嘧啶堿基的第5位的碳原子之間的碳鏈共價(jià)結(jié)合,形成

biotin-11-dUTP和biotin-16-dUTP復(fù)合物。

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制備生物素標(biāo)記探針：生物素-dUTP可取代dTTP而被整合進(jìn)DNA探針

生物素標(biāo)記的探針雜交結(jié)果可通過下列兩種途徑檢出：

生物素-抗生物素蛋白的親和系統(tǒng)

生物素-抗生物素抗體的免疫系統(tǒng)本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

用生物素標(biāo)記DNA探針-呈色/熒光法檢測(cè)雜交信號(hào)技術(shù)硝酸纖維濾膜靶標(biāo)DNAPPPPPP生色或熒光誘發(fā)物質(zhì)P呈色或發(fā)出熒光堿性磷酸酯酶鏈球菌抗生物素蛋白生物素(biotin)生物素標(biāo)記的探針圖:用呈色法或熒光法檢測(cè)核酸雜交信號(hào)本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分圖13-9生物素標(biāo)記探針檢測(cè)核酸過程示意圖

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（4）DNA分子雜交方法

-Southern斑點(diǎn)雜交將經(jīng)變性處理的DNA樣品直接點(diǎn)在濾膜上,固定后與探針雜交缺點(diǎn)：假陽(yáng)性出現(xiàn)頻率高用于快速檢測(cè)基因的整合情況-Southern印跡雜交基因組DNA經(jīng)酶切、電泳分離、變性、印跡轉(zhuǎn)移、固定后與探針雜交和檢測(cè)用檢測(cè)基因的整合和拷貝數(shù)等情況

-Southern原位雜交是將變性染色體固定在玻片上與探針進(jìn)行雜交。用于檢測(cè)基因在染色體上整合的位置本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

基因組DNADNA限制片段凝膠電泳分離DNA變性DNA印跡轉(zhuǎn)移固定、雜交檢測(cè)酶切Southern印跡雜交過程本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分圖13-10Southern印跡雜交過程

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分Southern原位雜交本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

2)RNA分子雜交技術(shù)-Northernblotting

Northern雜交是指用從生物細(xì)胞中提取的總RNA或mRNA與探針分子雜交

因此，可用于分析外源基因在受體生物中的轉(zhuǎn)錄情況本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

(1)RNA印跡雜交原理

檢測(cè)原理和步驟與Southern印跡雜交大致相同

不同之處：

應(yīng)用變性瓊脂糖凝膠電泳分離不同大小的RNA分子變性瓊脂糖凝膠：在膠液中加入變性劑

甲醛常用變性劑乙二醛*等*乙二醛的兩個(gè)乙醛基團(tuán)可與鳥嘌呤的亞氨基團(tuán)反應(yīng)，形成環(huán)狀衍生物以維持RNA的變性狀態(tài)。

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為什么要使用變性瓊脂糖凝膠介質(zhì)？？因?yàn)橹挥性谧冃詶l件下電泳，破壞RNA的空間結(jié)構(gòu),才能使RNA在凝膠介質(zhì)中的遷移距離與其分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值成正比。

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RNASecondaryStructure本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

(2)

RNA印跡雜交方法

-Northern斑點(diǎn)雜交用于快速檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄情況,但不能檢測(cè)出轉(zhuǎn)錄的mRNA片段大小。

-Northern印跡雜交用于檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄情況,同時(shí)可以檢測(cè)出mRNA轉(zhuǎn)錄本的大小及其轉(zhuǎn)錄水平等。

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例:Northern印跡雜交結(jié)果

圖:DcLEA1基因在胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)育的不同階段的表達(dá)

上圖為Northern雜交結(jié)果,下圖為總RNA電泳圖(10ug/泳道)泳道1.調(diào)控狀態(tài)下的體細(xì)胞胚泳道2-5.分別為解調(diào)控12、24、36、48h的體細(xì)胞胚

28s18s本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

注意：細(xì)胞中的總RNA包括：mRNA占1-5%rRNA80-85%tRNA和sRNA14-19%rRNA電泳后可以觀察到3條特征條帶：28S18S5S*因此，rRNA的特征條帶是用來鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法三.核酸操作技術(shù)

RNA印跡雜交中注意的兩點(diǎn):電泳凝膠中不加EtBr,因EtBr與RNA結(jié)合后遷移速率下降。

所有的器皿、水和試劑必須經(jīng)RNase滅活處理，防止RNA的降解。

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內(nèi)容回顧：凝膠電泳技術(shù)難點(diǎn)：大于50kb片段的電泳分離。Sourthern雜交技術(shù)難點(diǎn)：酶切和變性。Northern雜交技術(shù)

難點(diǎn)：去除RNase；跑變性膠。

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基因擴(kuò)增

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程,在體外快速擴(kuò)增特定DNA序列的方法。

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基因擴(kuò)增

1)發(fā)展歷史1985年，美國(guó)科學(xué)家KaryMullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對(duì)酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。1988年，Saiki等人水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。1993年，KaryMullis因此而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

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基因擴(kuò)增

2)PCR反應(yīng)原理

DNA聚合酶能夠以引物3’-OH為起點(diǎn)，催化dNTP按模板順序，合成與模板互補(bǔ)的新鏈。PCR反應(yīng)的過程，即DNA解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、鏈的延伸可以被不斷重復(fù)。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)達(dá)到2n，能滿足進(jìn)一步遺傳分析的需要。

擴(kuò)增體系包括：模板DNA（單、雙鏈DNA）

引物4種等量混合的dNTPDNA聚合酶

DNA聚合酶的緩沖液

P.177圖5-9本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

3)模板DNA的制備PCR對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求不高,可用：細(xì)胞裂解液提取的染色體DNA質(zhì)粒DNA本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分4)DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（來自Thermusaquatics）

特點(diǎn)：5’—3’的聚合酶活性5’—3’的核酸外切酶活性無3’—5’的核酸外切酶活性

擴(kuò)增的DNA片段在3’有一個(gè)突出的A堿基?？梢赃x用“T”載體進(jìn)行擴(kuò)增片段的克隆，常用的載體有pGEM-T，質(zhì)粒兩末端突出的T與片段兩端突出的A互補(bǔ)。

第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分pfuDNA聚合酶（來自激烈熱球菌Pyrococcusfariosus）

特點(diǎn)：

5’—3’的聚合酶活性5’—3’的核酸外切酶活性3’—5’的核酸外切酶活性擴(kuò)增的DNA片段為平末端。可用開環(huán)(EcoRV單酶切)的pBluescript質(zhì)?？寺?。第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

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基因擴(kuò)增

5)PCR循環(huán)參數(shù)

_____________________________________________________

溫度反應(yīng)時(shí)間循環(huán)數(shù)______________________________________________________

預(yù)變性94-95C45s-5min，取決于模板的復(fù)雜性1(a)變性94-95C取決于聚合酶的種類(b)退火(anneal)取決于引物的

長(zhǎng)度、GC含量

取決于聚合酶種類

及引物與模板的

25-30

配對(duì)程度(c)延伸72C取決于被擴(kuò)增片段大小完成72C5-10min,取決于聚合酶種類1________________________________________________________________本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

例:

PCR參數(shù)

反應(yīng)體系

階段溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)DNA模板1l預(yù)變性94℃

45’’1引物11l(50ng/l)引物21l(50ng/l)變性94℃

45’’dNTPs1l(10mM/每種)退火45’’25Pfu緩沖液5l延伸72℃Pfu聚合酶0.5lH2O40.5l完成72℃

10min1Tm=55℃;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度是3044bp。PfuDNA聚合酶，每擴(kuò)增1000bp需要1-2min。50℃6min本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

6)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳（片段小于100bp）。檢測(cè)是否有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子片段（DNAMarker）相比較，判斷擴(kuò)增片段的大小是否正確。

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基因擴(kuò)增

例:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

圖:DcLEA1基因PCR鑒定泳道1-9：不同樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物泳道M：分子量標(biāo)記泳道10：陰性對(duì)照856bp1234567M8910Kb215.04.22.01.51.30.90.5本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

7)引物設(shè)計(jì)及合成

用于PCR擴(kuò)增的引物，一般為15-30個(gè)核苷酸，主要通過人工合成獲得。

引物設(shè)計(jì)的基本原則:

引物中的(G+C)含量應(yīng)在45-65%;4種堿基應(yīng)隨機(jī)分布,避免單一堿基的連續(xù)排列；防止引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(loop);兩引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ),尤其在引物的3’端要避免“二聚物”的形成；如需引入酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)通常放在引物的近5’端。一般情況下,引物的設(shè)計(jì)應(yīng)利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。

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基因擴(kuò)增

2.

反轉(zhuǎn)錄-PCR(reversetranscribed-PCR，RT-PCR)技術(shù)

用于cDNA（complementaryDNA，互補(bǔ)DNA）的合成。1）原理是以提取的總RNA或mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,并以此為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

RT-PCR反應(yīng)包括：cDNA的合成

兩個(gè)部分cDNA的擴(kuò)增

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

2）第一鏈cDNA的合成p.187-以mRNA為模板-DNA引物-由反轉(zhuǎn)錄酶催化-四種等量混合的dNTP

使用什么引物????本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

以olig(dT)為引物合成mRNA的第一條cDNA鏈。P.187

5′

AAAAAA3′mRNA

3′TTTTTTT5′cDNA反轉(zhuǎn)錄酶

olig(dT)引物

mRNA3’端的互補(bǔ)序列為引物5′AAAAAA3′mRNA3′5′cDNA反轉(zhuǎn)錄酶

特異引物隨機(jī)引物本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分RT-PCR過程示意圖本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

3）第二鏈cDNA合成-以第一鏈cDNA為模板-引物-由DNA聚合酶催化-dNTP引物從何而來??本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

cDNA第二鏈的合成方法有兩種:自身引導(dǎo)法-第一條cDNA鏈合成后，cDNA:RNA雜交鏈變性；-

利用單鏈cDNA3’端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，為第二條cDNA鏈的合成提供引物；-由大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段催化合成第二條cDNA鏈；-用對(duì)單鏈特異性的S1核酸酶切除末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到cDNA雙鏈。缺點(diǎn)：合成反應(yīng)較難控制，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)會(huì)導(dǎo)致末端序列的缺失，因而該方法目前很少使用。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

置換合成法第一條cDNA鏈合成后，產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈無需變性。-用RNaseH酶切割雜交鏈中的mRNA鏈，在mRNA鏈上造成切口和缺口，利用一系列小的RNA片段為引物。-由大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ催化合成第二條cDNA鏈。-最后由DNA連接酶將小的cDNA片段連接成完整的cDNA鏈。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

RNaseH：-是一種核糖核酸內(nèi)切酶，特異性水解DNA：RNA雜交鏈中RNA鏈。-該酶對(duì)單鏈的核酸、雙鏈DNA或雙鏈RNA沒有作用。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

置換合成法的優(yōu)點(diǎn):

-非常高效。-直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，無須進(jìn)一步處理和純化。-不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)，能保持cDNA序列的完整性。是目前合成cDNA常采用的方法。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

cDNA的擴(kuò)增以cDNA單鏈或雙鏈為模板，在特異性引物的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第56頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

4）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建p.188

cDNA文庫(kù)：

從真核生物的組織或細(xì)胞中提取各種RNA，通過RT-PCR合成cDNA，將雙鏈cDNA分別和適當(dāng)載體連接后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所獲得菌落或噬菌體的集合即為該生物的cDNA文庫(kù)。

克隆載體：cDNA的長(zhǎng)度一般在0.5-8kb。常用載體有：質(zhì)粒載體和噬菌體載體。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第57頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分cDNA文庫(kù)的構(gòu)建過程本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第58頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分cDNA文庫(kù)的用途：-可用于真核生物基因的克隆、表達(dá)和調(diào)控的分析;-比較cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問題。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第59頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

3.反向PCR(reversePCR)

用于擴(kuò)增已知DNA區(qū)段之外的末知序列。

原理:先用一種已知

DNA區(qū)段上沒有切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶,從已知

DNA區(qū)段有一定距離的兩側(cè)位置切割DNA分子,然后將這些片段作分子內(nèi)連接成環(huán)形。根據(jù)己知的靶DNA序列按向外延伸的要求設(shè)計(jì)一對(duì)引物,保證被擴(kuò)增的是位于靶DNA區(qū)段兩側(cè)的末知DNA序列。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第60頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法四.

基因擴(kuò)增

引物1引物2引物1引物2圖:反向PCR的基本操作程序引物2本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第61頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger和Coulson，1977)Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam和Gilbert，1977)DNA自動(dòng)測(cè)序法質(zhì)譜法單分子測(cè)序法原子探針顯微鏡測(cè)序法流式細(xì)胞儀測(cè)序法大規(guī)模平行測(cè)序法、DNA芯片法

經(jīng)典方法新方法本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第62頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

1.Sanger雙脫氧鏈終止法（引物合成法）1）

原理:利用DNA聚合酶在體外合成DNA時(shí)，能夠?qū)?’,3’-ddNTP（雙脫氧核糖核苷三磷酸）摻入到寡核苷酸鏈的3’-末端這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第63頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第64頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析5′3′5′5′3′3′ddNTP摻入到DNA合成反應(yīng)后導(dǎo)致反應(yīng)終止正常的DNA合成反應(yīng)本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第65頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

在測(cè)序反應(yīng)體系中加入：-模板DNA(3’5’的單鏈)-特異性引物（帶標(biāo)記的）-DNA聚合酶（測(cè)序酶）-dATP、dTTP、dGTP、dCTP和一種ddNTP在合成反應(yīng)中，當(dāng)這種2’,3’-雙脫氧ddNTP加到寡核苷酸鏈生長(zhǎng)末端,由于ddNTP沒有3’-OH基團(tuán),寡核苷酸鏈不能繼續(xù)延長(zhǎng)。在同一反應(yīng)中,將會(huì)合成出不同長(zhǎng)度的DNA片段混合物，這些片段具有相同的5’-末端和以ddNTP結(jié)束的3’-末端。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第66頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

將這種混合物加到可以區(qū)分長(zhǎng)度僅差一個(gè)核苷酸的不同DNA片段的變性凝膠中進(jìn)行電泳分離,就可以獲得一系列全部以3’-末端ddNTP為終止殘基的DNA片段的電泳圖譜。通過放射自顯影的方法檢測(cè)單鏈DNA片段的放射性條帶,就可以直接讀出DNA的核苷酸順序。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第67頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

雙脫氧鏈終止法測(cè)序的基本原理和過程

凝膠電泳方向3’AGTTGCTA5’測(cè)序膠的判讀*放射性標(biāo)記(測(cè)序酶)本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第68頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

2.Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法

1）原理:

用化學(xué)試劑處理末端帶有放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此在同一反應(yīng)中產(chǎn)生具有共同起點(diǎn)(放射性標(biāo)記末端)到發(fā)生化學(xué)切割位點(diǎn)的一組長(zhǎng)度不同的DNA片段。反應(yīng)混合物經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后,便可根據(jù)X光片底板上所顯現(xiàn)的相應(yīng)譜帶,讀出DNA片段的核苷酸順序。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第69頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

2）方法（1）DNA樣品制備

首先要對(duì)待測(cè)定的單鏈DNA片段的5’端作末端標(biāo)記。

（2）堿基切割常用的化學(xué)試劑:

硫酸二甲酯

-在酸性條件下,對(duì)G特異性切割-在中性條件下,它作用于G+A。

肼又稱聯(lián)氨(NH2?NH2)-在堿性條件下,它能夠作用于T+C.-在NH2?NH2+鹽的條件下,對(duì)C特異性切割。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第70頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

硫酸二甲酯酸性中性肼堿性+鹽

32P圖:Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法原理本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第71頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法這兩種序列測(cè)定技術(shù)原理大同小異。它們都是生成互相獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點(diǎn)，但卻隨機(jī)終止于特定的一種核苷酸殘基上。由于DNA上的每一個(gè)堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會(huì)均等,因此上述每一組產(chǎn)物都是一些長(zhǎng)短不同的寡核苷酸混合物。然后在可以區(qū)分長(zhǎng)度僅差一個(gè)核苷酸的不同DNA分子的條件下，對(duì)各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，即可以從凝膠的放射自顯影膠片上直接讀出DNA上的核苷酸序列。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第72頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

3.DNA序列自動(dòng)分析法

原理:

-基于Sanger雙脫氧鏈終止法的原理，使用四種不同的

熒光染料分別標(biāo)記ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。-這四種熒光染料在激光激發(fā)下發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光，因而每一種熒光代表一種堿基。-延伸中的DNA互補(bǔ)鏈分別終止于不同熒光標(biāo)記的ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。

-熒光檢測(cè)系統(tǒng)將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào),經(jīng)過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理,最后把所測(cè)得的序列直接打印出來。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第73頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第74頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

ddAddGddTddGddCddCddAddCddGddT激光激發(fā)熒光信號(hào)AGTGCCACGT電泳鏈終止反應(yīng)本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第75頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第76頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法五.

核苷酸序列分析

4.DNA雜交測(cè)序法（芯片測(cè)序）

原理:利用一組己知序列的寡核苷酸短序列作為探針,同某一特定的較長(zhǎng)的靶DNA分子進(jìn)行雜交,從而測(cè)定其核苷酸的序列。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第77頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分雜交測(cè)序法(SBH)：

應(yīng)用一套已知序列的寡核苷酸探針去尋找靶DNA鏈上的互補(bǔ)序列，靶DNA上的序列根據(jù)雜交情況來確定。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第78頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分12-mer的靶DNA序列：AGCCTAGCTGAA靶DNA的互補(bǔ)序列運(yùn)用八聚體探針微型高密度寡核苷酸點(diǎn)陣的制備本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第79頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法六.

DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究

凝膠阻滯試驗(yàn)(DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn))

用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。原理:在凝膠電泳中,由于電場(chǎng)的作用,裸露的DNA向正極方向移動(dòng)的距離與其相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比。如果此時(shí)DNA分子與某種蛋白質(zhì)結(jié)合,那么它的相對(duì)分子質(zhì)量增大,它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯,在同樣的電泳電壓和時(shí)間內(nèi)向正極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第80頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法六.

DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究

(a)(b)(c)圖:在凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中競(jìng)爭(zhēng)DNA與標(biāo)記DNA之間的競(jìng)爭(zhēng)作用

凝膠電泳放射自顯影特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記DNA競(jìng)爭(zhēng)DNA蛋白質(zhì)與競(jìng)爭(zhēng)DNA結(jié)合蛋白質(zhì)與標(biāo)記DNA結(jié)合阻滯條帶阻滯條帶本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第81頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法六.

DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究

2.DNaseI足跡試驗(yàn)(DNAfoot-printingassay)

原理:先將待檢測(cè)的雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記,并用限制性內(nèi)切酶去掉其中的一個(gè)末端,得到只有一個(gè)末端標(biāo)記的雙鏈DNA分子,然后與蛋白質(zhì)混合。

在標(biāo)記的DNA樣品(對(duì)照）和蛋白質(zhì)、標(biāo)記DNA混合物中分別加入少量的DNaseI對(duì)DNA分子進(jìn)行切割。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第82頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法六.

DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究

如果某種特異蛋白能夠與DNA分子的某一特定區(qū)段結(jié)合,那么,它將保護(hù)DNA這一區(qū)段上的酶切位點(diǎn)免受DNaseI的切割,因而也就不能產(chǎn)生出相應(yīng)長(zhǎng)度的切割條帶(與對(duì)照相比)，在電泳凝膠的放射自顯影圖片上,與對(duì)照相比將出現(xiàn)一個(gè)空白區(qū)域，這一區(qū)域被稱之為“足跡”。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第83頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法六.DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究

加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影足跡圖:DNaseI足跡試驗(yàn)標(biāo)記的靶DNA片段,箭頭為DNaseI酶切位點(diǎn)；標(biāo)記的DNA與特異蛋白結(jié)合后,切割位點(diǎn)6,7,8被蛋白質(zhì)保護(hù)而免受DNaseI的切割；DNaseI切割、凝膠電泳后的放射自顯影。A為對(duì)照;B為樣品(標(biāo)記DNA+蛋白質(zhì))。

678本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第84頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法七.

Western印跡雜交

Western印跡雜交(Westernblotting)技術(shù)

用于檢測(cè)目的基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。如果目的基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種酶,則可以通過測(cè)定轉(zhuǎn)基因生物體中該酶的活性,來達(dá)到了解該基因表達(dá)情況的目的。如表達(dá)產(chǎn)物不是酶,那么就要采用免疫學(xué)方法(Westernblotting)檢測(cè)。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第85頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法七.

Western印跡雜交

Western印跡雜交原理

當(dāng)目的基因在生物體內(nèi)正常表達(dá)時(shí),組織細(xì)胞中含有一定量的目的蛋白。

-用目的蛋白的抗體(稱為一抗)與目的蛋白反應(yīng)；-再用能與一抗特異結(jié)合的標(biāo)記抗體(稱為二抗)反應(yīng)；-最后通過二抗上標(biāo)記化合物的性質(zhì)對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行分析。

本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第86頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法七.

Western印跡雜交

2.Western雜交方法有印跡雜交和斑點(diǎn)雜交之分。1)Western印跡雜交分析（1）蛋白質(zhì)的提取（2）蛋白質(zhì)樣品的處理

采用含有SDS

(十二烷基硫酸鈉)和-巰基乙醇的樣品緩沖液處理蛋白質(zhì)樣品。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第87頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法七.

Western印跡雜交

SDS的作用：

-使蛋白質(zhì)的亞基解聚,SDS陰離子與松散多肽鏈結(jié)合。-使樣品中的蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合后,都帶上大量的負(fù)電荷（由于SDS帶有大量負(fù)電荷）,這樣各蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異就被掩蓋,剩下的只是分子質(zhì)量的差異,此時(shí),蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率取決于它們的分子質(zhì)量。

-硫基乙醇：

-

使二硫鍵還原,多肽鏈由特定的三維結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮⒌纳煺範(fàn)?。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第88頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法七.

Western印跡雜交

（3）SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳分離

用SDS(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis

)凝膠電泳分離。在蛋白質(zhì)樣品和聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS后，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，其它因素可以忽略不計(jì)。

(4)

蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移

硝酸纖維素濾膜,疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合。本文檔共100頁(yè)；當(dāng)前第89頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)24分第五章分子生物學(xué)研究法七.

Western印跡雜交

（5）膜的封閉

將濾膜浸泡在一種非特異性的蛋白溶液中為什么要進(jìn)行封閉處理？？-由于第一抗體是蛋白質(zhì)-