分子生物學基因治療

關(guān)于分子生物學基因治療第1頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三一、基因治療的概念1990人類第一例基因治療獲得成功1966年，Lederberg提出基因治療概念基因治療(genetherapy)：將正?；蛑踩氚屑毎孢z傳缺陷的基因,或關(guān)閉、抑制異常表達的基因，以達到預(yù)防和治療疾病的一種臨床治療技術(shù)。人類疾病治療的重大突破!與傳統(tǒng)的方法相比較，從根本上消除遺傳病因。第2頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三二、基因治療類型和途徑生殖細胞基因治療(germinalgenethrapy)體外（exvivo）間接基因治療

體細胞基因治療(somaticgenethrapy)1、類型2、途徑

體內(nèi)（invivo）直接基因治療第3頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三1、基因矯正：原位修復(fù)缺陷基因原位替換（同源重組）2、基因添加：正?；蚍翘禺惒迦牖蚪M以補償異常基因的功能缺陷3、基因失活：抑制、關(guān)閉異常表達的基因矯正突變?nèi)⒒蛑委煹牟呗?、重新開放已關(guān)閉的基因第4頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三四、基因治療的方法（一）體細胞的基因治療方法

2、受體細胞的選擇3、將治療轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)4、將帶有目的基因的細胞重新輸回體內(nèi)體外基因治療時（二）反義技術(shù)（antisensetechnology)（三）RNA干擾（shortinterferenceRNA)1、治療基因的制備第5頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三五、基因治療的現(xiàn)狀1、一些單基因病的治療

嚴重復(fù)合免疫缺陷癥（ADA綜合癥）、血友病B、囊性纖維化（CF），苯丙酮尿癥等2、Bata-地中海貧血病別醇嘌呤重新開放r基因3、多基因病心血管疾病，糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等4、腫瘤5、其它疾?。篐IV第6頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三六、基因治療的問題、前景問題：1、穩(wěn)定性2、安全性3、導(dǎo)入基因的高效表達4、免疫性5、倫理問題

前景：十分有潛力的技術(shù)，有深遠的意義

“基因治療作為一項新的治療技術(shù)，將不只限于遺傳病和腫瘤的治療，在可見的將來，它將是臨床上多種疾病可選擇的治療方法。”

第7頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三應(yīng)用腺苷脫氨酶基因ADA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入嚴重復(fù)合免疫缺陷癥（SCID）第8頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三遺傳病的常規(guī)治療（一）外科治療矯正畸形、組織和器官移植（二）內(nèi)科治療用藥物及飲食治療

1、禁其所忌酶缺乏不能對底物進行正常代謝的遺傳病。

2、去其所余酶缺乏使體內(nèi)貯存過多的“毒物”所致的遺傳病

促排泄劑或螯合劑、換血或血漿過濾等

3、補其不足由于基因缺陷使體內(nèi)缺乏某種酶和蛋白質(zhì)而導(dǎo)致功能喪失的遺傳病。第9頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三第10頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三ACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAAACGTCGGTGCGTCGCTTTGCAGCCACGCAGCGAACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAA突變基因原位修復(fù)突變修復(fù)第12頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三帶異?；虻娜旧wDNA分子帶正常基因的外源同源片段同源重組過程第13頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三添加正常基因第14頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三使γ重新表達，形成HbF,HbF代償HbA的功能。第15頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三目的基因的制備方法1、從基因組中分離2、化學合成3、用mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA4、從基因文庫中篩選5、PCR合成第16頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三受體細胞的選擇

選擇受體細胞的原則：

1、易于從人體分離又便于輸回體內(nèi)2、易于接受外源的遺傳物質(zhì)3、能夠分裂，生命周期長4、患病的器官或部位。常用的受體細胞：骨髓干細胞皮膚纖緯細胞血管內(nèi)皮細胞肝細胞淋巴細胞第17頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三治療基因的轉(zhuǎn)移方法3、腺相關(guān)病毒(Adeno-AssociatedVirus,AAV)4、單皰疹病毒(Herpessimplexviruses,HSV)化學法磷酸鈣共沉淀物理法微粒轟擊、電穿孔法、顯微注射脂質(zhì)體法生物法將病毒（virus)改造成缺陷病毒載體1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（

Retroviruses)2、腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（Adenoviruses）第18頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三脂質(zhì)體法優(yōu)點：易大量制備無致病性細胞類型多治療過程可控缺點：轉(zhuǎn)化效率不高血循中快速清除(肝巨噬細胞)第19頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三逆轉(zhuǎn)錄病毒的改造第21頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞過程第22頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三逆轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)缺點優(yōu)點：1、能高效率的感染宿主細胞（100%）2、其宿主范圍廣泛，包括來自不同種的生物和細胞類型3、被整合的基因在宿主基因組中穩(wěn)定表達4、用復(fù)制缺陷的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，毒性小缺點：1、只能感染分裂細胞2、其外源DNA的容量太小3、安全性問題（激活癌基因的潛在性）第23頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三腺病毒感染細胞的過程第24頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)缺點優(yōu)點：1、具有較廣的宿主范圍，能感染除造血細胞以外的幾乎所有細胞2、可以感染分裂及非分裂細胞3、能高效地感染宿主細胞4、外源基因容量大5、安全性較高（不引起癌基因激活）缺點：1、技術(shù)上需進一步改進2、不整合到人類基因組腺病毒是基因治療載體的發(fā)展方向。第25頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三1、野生型的AAV為非病原性，其安全性高2、AAV病毒顆粒的物理化學性質(zhì)較為穩(wěn)定3、應(yīng)用宿主范圍較廣，使用于分裂及非分裂細胞4、可整合入宿主染色體上，可長期表達目的蛋白腺相關(guān)病毒載體優(yōu)點：缺點：重組AAV的制作較為繁雜、效率低，滴度低第26頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三單皰疹病毒載體優(yōu)點

具有對神經(jīng)元的特異的親和力可插入的基因片段容量很大，可達40-50kb缺點

對細胞有較大的毒性第27頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三反義技術(shù)

反義技術(shù)（antisensetechnology)也稱反義寡核苷酸,是指利用人工合成的反義RNA或反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，控制細胞生長的中間階段，使基因不能轉(zhuǎn)錄或翻譯，因而不能合成蛋白質(zhì)，以達到治療某中疾病的目的。(1)將cDNA導(dǎo)入基因組中，轉(zhuǎn)錄得反義RNA(2)直接輸入反義寡核苷酸二、反義基因技術(shù)（阻斷轉(zhuǎn)錄）類型：1、反義RNA技術(shù)（阻斷翻譯）第28頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三

第29頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三

第30頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)錄阻斷反基因技術(shù)示意圖第31頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三第32頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三正常細胞(無細胞毒性)胞嘧啶脫氨酶基因erbB-2啟動子5-FC5-FC5-FU

(細胞毒性)腫瘤細胞腫瘤特異性高表達因子藥物靶向治療腫瘤細胞死亡第33頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三RNA干擾（RNAinterferenceRNAi)

2003年10大科學進展--第四(Science)正常生物體內(nèi)一些小的雙鏈RNA可以抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象。當細胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的小雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)時，可以通過促使該mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達，從而導(dǎo)致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。這些小的雙鏈RNA稱為siRNA(Small/shortinterferingRNA，siRNA)。第34頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三RISC:RNA-inducedsilencingcomplexRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物第35頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三RNAiingenetherapy第36頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三基因治療的現(xiàn)狀-1第37頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三基因治療的現(xiàn)狀-2第38頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三基因治療的現(xiàn)狀-3第39頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三基因治療的現(xiàn)狀-4第40頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三基因治療的現(xiàn)狀-5第41頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三基因治療的現(xiàn)狀-6第42頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三HemophiliaB,FIXfunctionreduced,X-linkedMalestobleedaftercircumcision第一例臨床實驗——中國上海1995-1996年載體——AAV自體皮膚成纖維細胞兩名血友病B患者(兄弟),先后治療了四名患者FIX水平升高2倍并持續(xù)了1年以上2003年獲得國家批準進行中國首次AAV基因治療血友病B臨床試驗中國的基因治療第43頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三AAVbasedgenetherapyforhemophiliaB1.ViralgenesareremovedfromAAV2.AgeneforbloodclottingproteinFactorIXisplacedinsidetheemptyAAV3.TheFacto