小鼠血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良

小鼠血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良【摘要】目的建立一種簡(jiǎn)單方便但高效的血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。方法改良酶消化法。結(jié)果用該法培養(yǎng)細(xì)胞傳代生長(zhǎng)快，細(xì)胞純度達(dá)98%以上，足以滿足各種細(xì)胞試驗(yàn)需求。結(jié)論與傳統(tǒng)方法相比該法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，試驗(yàn)成功率高，節(jié)省材料和時(shí)間，而且可獲得小鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

AbstractObjectiveTocreateasimpleandeffectiveprimaryculturemethodsformousevascularsmoothmusclecells(VSMC).MethodsReformedenzymaticdigestion.ResultsVSMCwasgrownwellandfast,thepurityismorethan98%whichcanmeetvariouscelltests.ConclusionComparingwithtraditionalmethods,thisapproachescansavemuchtimeandmorematerials,alsohavebettercellquantitiesandpurity.

KeywordsMouseAortaVSMCPrimarycult

在心血管疾病的基礎(chǔ)研究中，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞生物特性的研究是極其重要的一部分，其對(duì)揭示血管病變機(jī)理至為關(guān)鍵。體外培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞是常用試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，近年?lái)隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，原代培養(yǎng)的成功率有所提高，但仍然存在許多問題，經(jīng)驗(yàn)不足者往往要花費(fèi)大量時(shí)間、精力去摸索，不但影響試驗(yàn)進(jìn)程而且浪費(fèi)材料，而有些組織材料是極為昂貴且很難獲得的，所以為了提高平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率，并在有限的材料下獲得好的結(jié)果，我們大膽采用了酶消化法，從取材方法及消化步驟等方面進(jìn)行了改良，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，成功率高，細(xì)胞生長(zhǎng)快，純度高，現(xiàn)介紹如下。

1材料與試劑

1．1組織來(lái)源：C57BL/6J小鼠(鼠齡8周以后)主動(dòng)脈。

1．2試劑：鼠抗SMC-α-actin,Cy2conjugatedaffinitypurifiedanti-mouseIgG［H/L］，戊巴比妥鈉注射液。

1．3培養(yǎng)基：在DMEM培養(yǎng)基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、鏈霉素、１％谷氨酰胺，過濾除菌備用。

1．4酶消化液：CollagenaseTypeⅡ7mg溶于5mlDMEM培養(yǎng)基中(無(wú)血清)，過濾除菌即用。

1．5７０％乙醇：用無(wú)菌蒸餾水配制。

1．6器械、儀器：齒、平鑷，組織、眼科剪，無(wú)菌注射器，培養(yǎng)皿，解剖顯微鏡，熒光顯微鏡(LEICADMI6000B）。

2方法

2．1常規(guī)麻醉小鼠，70％乙醇沖洗頸部和腹部,打開胸、腹腔,暴露心臟。

2．2５mL注射器穿刺左心室，PBS緩沖液沖洗主動(dòng)脈。

2．3完整分離主動(dòng)脈，放入100mm無(wú)菌平皿，滴1～2滴PBS緩沖液。

2．4解剖顯微鏡下撕去血管外膜至血管光滑透明。

2．5取出血管，放入另一有PBS緩沖液的平皿里，轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)操作。

2．6眼科剪將血管快速剪成１～２mm2大小后用膠原酶消化３～４h。

2．7加入DMEM培養(yǎng)基終止消化并離心傾去上清液，離心管中加入1ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于１２孔培養(yǎng)板中的一孔，常規(guī)靜置培養(yǎng)。

2．8第2天觀察是否有細(xì)菌污染，如有要更換新鮮培養(yǎng)液，靜置培養(yǎng)。于第５、６天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)培養(yǎng)皿面積的８０％左右時(shí)可傳代，常規(guī)方法即可。

3細(xì)胞鑒定

免疫熒光法鑒定平滑肌細(xì)胞：常規(guī)消化，細(xì)胞接種于培養(yǎng)載玻片。第2天用PBS緩沖液輕緩洗滌，加％福爾馬林液在室溫下固定30min后用PBS緩沖液洗滌３次，２min／次。然后用％Triton-x-100(PBS配制)室溫下滲透細(xì)胞10min，以便抗體更好的進(jìn)入細(xì)胞。用10％山羊血清(PBS配制)封閉非特異性抗原30min，鼠抗SMC-α-actin室溫下孵育細(xì)胞２h，PBS緩沖液洗滌３次，５min／次。以下步驟避光：用熒光標(biāo)記二抗在室溫下孵育細(xì)胞１h，PBS緩沖液洗滌３次，５min／次，然后用熒光封片劑封片后在熒光顯微鏡下檢測(cè)。

4結(jié)果

細(xì)胞于第2天游離出，第3天沿細(xì)胞團(tuán)成放射狀生長(zhǎng)，成梭形，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，成典型的峰谷樣生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多呈寬大的長(zhǎng)梭形，核大一只小鼠的主動(dòng)脈用該法培養(yǎng)，１０天左右即可獲得１０6個(gè)細(xì)胞，傳代生長(zhǎng)快，可滿足任何細(xì)胞試驗(yàn)要求。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度達(dá)98%以上，免疫熒光檢測(cè)顯示細(xì)胞SMC-α-actin染色呈陽(yáng)性，綠色熒光呈束狀，顯示肌絲特征。

5討論

傳統(tǒng)的原代培養(yǎng)方法［１,２］有兩種，一種是酶消化法，將組織用合適的酶消化后培養(yǎng)，因除去了妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的間質(zhì)，所以產(chǎn)量高，但因步驟繁瑣，易發(fā)生污染且材料消耗較多，只適合培養(yǎng)大塊組織。另一種是組織塊培養(yǎng)法，將組織活體取出后剪切成小塊，貼于瓶壁等待細(xì)胞從組織四周游離出，該法細(xì)胞生長(zhǎng)較慢且不一定每塊都長(zhǎng)出細(xì)胞，所以成功率不高,但適合組織量少的細(xì)胞培養(yǎng)。目前國(guó)內(nèi)平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)多采用組織塊貼壁法［３～６］，因而也存在上述弊端。如何簡(jiǎn)化操作、提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率？在試驗(yàn)中我們反復(fù)比較，發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)的酶消化方法上進(jìn)行改良可獲得很好的效果，從而建立了上述改良的血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)。該方法將以往復(fù)雜的酶消化過程簡(jiǎn)化，大大減少了組織損失及污染機(jī)會(huì)，并簡(jiǎn)化了血管分離技術(shù)，使操作容易掌握，可重復(fù)性強(qiáng)，并且所培養(yǎng)的細(xì)胞活力強(qiáng)、生長(zhǎng)快。在試驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)如注意以下幾點(diǎn)可大大提高培養(yǎng)成功率：第一，要強(qiáng)調(diào)無(wú)菌觀念，所用器械要高壓消毒，打開胸、腹腔時(shí)所用的剪刀和鑷子不再重復(fù)使用，其他器械在使用中要不斷浸到70%乙醇中消毒滅菌，這樣做基本可避免污染。第二，選用鼠齡８W以上完全成年的小鼠。第三，使用解剖顯微鏡去除外膜，由于視野放大更能完整干凈的去掉血管外膜。第四，小鼠動(dòng)脈細(xì)小而薄，內(nèi)膜無(wú)須刮除。第五，掌握好消化時(shí)間，如果用新鮮的膠原酶，消化３h或略長(zhǎng)即可，太長(zhǎng)的時(shí)間可致細(xì)胞活力喪失。第六，在最初兩天盡可能不要?jiǎng)蛹?xì)胞，以免干擾細(xì)胞貼壁。

【參考文獻(xiàn)】

［1］司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)［M］.第二版.北京:世界圖書出版社，2007

［2］盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.第二版.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999.439-441

［3］王敏,崔連群.動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的改良及應(yīng)用［J］.山東醫(yī)藥，2004,44(14)：17-18

［4］馮大明,萬(wàn)載陽(yáng).組織塊法培養(yǎng)大鼠腸系膜小動(dòng)脈的平滑肌