幾種培養(yǎng)基的配方

一.土壤樣品的采集第一種:選擇植被群落具有代表性的固定樣方,除去地面植被和地表覆蓋物,每樣方采用土壤剖面法和多點(diǎn)混合取樣法采樣,將土樣混勻,用四分法棄去多余樣品,取500g裝入滅菌信封,帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行土壤微生物分離（4℃保存）、計(jì)數(shù)第二種:在小區(qū)內(nèi)機(jī)械抽取6株樣木，距樹(shù)干基部0.5m呈梅花形分布挖取根系周圍0～20cm、20～40cm和40～60cm土樣，分層充分混合后作為非根際土壤樣品。同時(shí)采集各層直徑小于0.2～0.5cm細(xì)根上粘附的土壤，分層充分混合作為根際土壤。供微生物分析的鮮土樣裝入已消毒過(guò)的密封塑料袋，帶入實(shí)驗(yàn)室。二.三大類土壤微生物分離與數(shù)量測(cè)定1.細(xì)菌的分離與數(shù)量測(cè)定(1)以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。稱取土壤鮮樣10g在無(wú)菌條件下用無(wú)菌水配成不同濃度梯度懸浮液，取稀釋度為10-3，10-4，10-5，10-6，10-7土壤懸浮液各50μL，接種于盛有滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用無(wú)菌刮刀涂抹均勻。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，恒溫(28℃)培養(yǎng)3d，選取每皿菌落數(shù)為15-150的1菌數(shù)(cfu/g)=（菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）÷干土%（Ⅰ）牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，配方如下：牛肉膏3.0g瓊脂18g蛋白胨5.0g蒸餾水1000mLpH7.0—7.22.真菌的分離與數(shù)量測(cè)定以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。即稱取土壤鮮樣10g,在無(wú)菌條件下用無(wú)菌水配成不同濃度梯度懸浮液,取稀釋度為10-2，10-3，10-4的土壤懸浮液各50μL，接種于盛有滅菌的馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用無(wú)菌刮刀涂抹均勻。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù),恒溫(25℃)培養(yǎng)5～7d，選取每皿菌落數(shù)為15～150的1馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基，配方如下：葡萄糖10.0gMgSO4.7H2O1.0gKH2PO41.0g瓊脂15g蛋白胨5.0g孟加拉紅(RoseBangal)每升加1%溶液0.33mL1%鏈霉素3mL蒸餾水1000mLpH自然臨用前再加入1%鏈霉素3mL3.放線菌數(shù)量測(cè)定以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。除取稀釋度為10–3，10–4，10-5的土壤懸浮液各50μl接種于盛有滅菌的改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基外，其余與細(xì)菌數(shù)量測(cè)定方法相同。恒溫(28℃)培養(yǎng)7～10d培養(yǎng)基改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基，配方如下：可溶性淀粉20gKNO31.0gFeSO4.7H2O0.01gK2HPO40.5gMgSO47H2O0.5gNaCl0.5g瓊脂18gK2Cr2O40.01g蒸餾水1000mlpH7.2～7.4臨用時(shí)加10%重鉻酸鉀1ml/300ml,抑制細(xì)菌生長(zhǎng)二.土壤各類微生物生理群落數(shù)量測(cè)定1.好氣性纖維素分解菌數(shù)量測(cè)定好氣性纖維素分解菌數(shù)量測(cè)定采用平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。在滅菌的盛有赫奇遜氏培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中放一塊直徑與培養(yǎng)皿等大的滅菌無(wú)淀粉濾紙(事先用1%稀醋酸浸泡一晝夜，并用2%的蘇打水洗到中性)，用干凈、滅菌的玻璃刮刀壓平。取稀釋度為10-2，10-3，10-4的土壤懸浮液各50ｕl，接種于附有濾紙的培養(yǎng)基中，用無(wú)菌刮刀涂抹均勻。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，恒溫(28℃)培養(yǎng)14d-18d，按上述方法和公式(Ⅰ)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算每g培養(yǎng)基配方如下:羧甲基纖維素納10g(NH4)2SO40.5gKH2PO41.0gCaCl20.1gMgSO40.2g瓊脂20g培養(yǎng)基采用赫奇遜(Hutchinson)氏培養(yǎng)基，配方如下:KH2PO41.0gNaNO32.5gNaCl0.1gCaCl20.1g瓊脂20gMgSO4.7H200.3gFeCl30.01g蒸餾水1000mlpH7.2—7.32.嫌氣性纖維素分解菌數(shù)量測(cè)定嫌氣性纖維素分解菌數(shù)量測(cè)定采用稀釋法。分別將15ml培養(yǎng)基分裝于試管中(深層造成嫌氣條件)。各管插入1條1cm×10cm濾紙條，一個(gè)大氣壓滅菌30min。將稀釋濃度為10-2，10-3，10-4，10-5的土壤懸液1ml接入試管，每稀釋度重復(fù)3次。另取3支試管接種lml無(wú)菌水作對(duì)照，于28—30℃培養(yǎng)14d—18d，取出檢查濾紙上的溶解區(qū)或紙屑的腐爛情況，并觀察濾紙條上是否出現(xiàn)菌落，以判斷嫌氣性纖維素分解菌的生長(zhǎng)。若在濾紙上生長(zhǎng)，則常綴上黃色、褐色或黑色的斑點(diǎn)。濾紙條一搖動(dòng)立即破裂。根據(jù)檢查得出數(shù)量指標(biāo)，然后根據(jù)數(shù)量指標(biāo)查Mecrady表，得出菌數(shù)近似數(shù)，按公式(2)計(jì)算出每g培養(yǎng)基采用奧曼粱斯基培養(yǎng)基，配方如下:(NH4)2SO41.0gK2HPO41.0gMgSO4.7H2O0.5gNaCl0.2gCaCO32.0g蒸餾水1000m13.自生固氮菌數(shù)量測(cè)定好氣性自生固氮菌數(shù)量測(cè)定采用平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。除恒溫(28℃)培養(yǎng)7d——l0d外，與真菌分離及其數(shù)量測(cè)定方法相同。(除取稀釋度為10–3，10–4，10-5的土壤懸浮液各50μl接種于盛有滅菌的改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基外培養(yǎng)基采用改良阿須貝(Ashby)無(wú)氮瓊脂培養(yǎng)基，配方如下：葡萄糖l0.0gK2HPO40.2gK2SO40.2gNaCl0.2gCaCO35gMgSO4.7H2O0.2g瓊脂18.0g4.反硝化細(xì)菌數(shù)量測(cè)定采用稀釋法。分別將15ml培養(yǎng)基分裝于試管中（造成嫌氣條件）。一個(gè)大氣壓滅菌20min。將稀釋度10–2，10–3，10–4，10–5，10–6的土壤懸浮液1ml接入試管，每稀釋度重復(fù)3次。領(lǐng)取試管接種1ml無(wú)菌水作對(duì)照，與28-30℃培養(yǎng)14d，檢查有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，如有菌生長(zhǎng)，一般有氣泡出現(xiàn)，培養(yǎng)液渾濁。同時(shí)使用奈氏試劑檢查是否有氨產(chǎn)生（加入奈氏試劑，若有氨產(chǎn)生，則由黃色或褐色沉淀出現(xiàn)）。再用格利斯試劑檢查是否有NO2-出現(xiàn)（加入格利斯試劑，若有NO2-出現(xiàn)，則呈紅色），并用二苯胺試劑檢查是否有NO3-出現(xiàn)（加入二苯胺試劑，若有NO3-出現(xiàn)，則呈藍(lán)色）。根據(jù)檢查得出數(shù)量指標(biāo)，然后根據(jù)最大然或法查Mecrady培養(yǎng)基采用組合培養(yǎng)基，配方如下：蛋白胨20.0g葡萄糖1.0gNaHPO42.0gKNO31.0g瓊脂1.0g蒸餾水1000ml三氮顯色試劑配制與使用（氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮）奈氏試劑的配制：將10g碘化汞和7g碘化鉀溶于10ml水中，另將24.4g氫氧化鉀溶于內(nèi)有70ml水的100ml容量瓶中，并冷卻至室溫。將上述碘化汞和碘化鉀溶液慢慢注入容量瓶中，邊加邊搖動(dòng)。加水至刻度，搖勻，放置2天后使用。試劑應(yīng)保存在棕色玻璃瓶中，置暗處。向培養(yǎng)液中加入奈氏試劑：如有氨氮存在（氨化細(xì)菌）將產(chǎn)生棕黃色絡(luò)合物沉淀。格里斯氏(Griess)試劑：A

液：對(duì)氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mLB

液：α萘胺0.1g，蒸餾水20mL,

稀醋酸(10%左右)150mL二苯胺試劑：二苯胺0.5g

溶于l00mL

濃硫酸中，用20mL

蒸餾水稀釋。在培養(yǎng)液液中滴加A、B

液后溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色或棕色等表示有亞硝酸鹽（亞硝化細(xì)菌陽(yáng)性）。先加入格里斯A液，完全去除亞硝態(tài)氮（也可直接加入醋酸和對(duì)氨基苯磺酸），然后加1～2

滴二苯胺試劑；如溶液呈藍(lán)色則表示培養(yǎng)液中存在有硝酸鹽（硝化細(xì)菌陽(yáng)性）。5.硝化細(xì)菌數(shù)量測(cè)定采用稀釋法。除只用格利斯試劑檢查否有NO2-出現(xiàn)（加入格利斯試劑，若有NO2-出現(xiàn)，則呈紅色）外，其余與反硝化細(xì)菌數(shù)量測(cè)定方法相同。培養(yǎng)基采用改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基,配方如下：（NH4）2SO42.0gMnSO44H2O0.01gNaHPO40.25gMgSO47H2O0.03gCaCO30.5gK2HPO40.75g蒸餾水6.氨化細(xì)菌數(shù)量測(cè)定(還不確定)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基測(cè)定調(diào)節(jié)PH7.2～7.4，121℃高壓滅菌30min.將接種后的蛋白胨氨化培養(yǎng)基在25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，用或然記數(shù)法測(cè)定。操作步驟（1）取牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基四支，分別接種土壤顆粒，大腸桿菌、枯草桿菌，余下一支不接種作為空白對(duì)照，在每支試管口懸掛一經(jīng)無(wú)菌水濕潤(rùn)的石蕊試紙，并加好試管塞。（2）將已經(jīng)接種的培養(yǎng)管置于28--30℃培養(yǎng)5--7最大或然數(shù)表

MPN計(jì)數(shù)是將待測(cè)樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量（如lm1）的稀釋液接種到新鮮培養(yǎng)基中沒(méi)有或極少出現(xiàn)生長(zhǎng)繁殖。根據(jù)沒(méi)有生長(zhǎng)的最低稀釋度與出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，采用“最大或然數(shù)”理論，可以計(jì)算出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。具體地說(shuō)，菌液經(jīng)多次10倍稀釋后，一定量菌液中細(xì)菌可以極少或無(wú)菌，然后每個(gè)稀釋度取3—5次重復(fù)接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，將有菌液生長(zhǎng)的最后3個(gè)稀釋度（即臨界級(jí)數(shù)）中出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的管數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)，由最大或然數(shù)表（見(jiàn)附錄九）上查出近似值，再乘以數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)，即為原菌液中的含菌數(shù)。如某一細(xì)菌在稀釋法中的生長(zhǎng)情況如下；稀釋度

10-3

10-4

10-5

l0-6

10-7

10-8重復(fù)數(shù)

5

5

5

5

5

5出現(xiàn)生長(zhǎng)的管數(shù)

5

5

5

4

1

0根據(jù)以上結(jié)果，在接種l0-3—10-5稀釋液的試管中5個(gè)重復(fù)都有生長(zhǎng)，在接種l0-6稀釋液的試管中有4個(gè)重復(fù)生長(zhǎng)，在接種10-7稀釋液的試管中只有1個(gè)生長(zhǎng)，而接種10-8稀釋液的試管全無(wú)生長(zhǎng)。由此可得出其數(shù)量指標(biāo)為“541”，查最大或然數(shù)表得近似值17，然后乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)（10-5的稀釋倍數(shù)為100000）。那么，1ml原菌液中的活菌數(shù)＝17×100000=17×105。即每毫升原菌液含活菌數(shù)為l700000個(gè)。在確定數(shù)量指標(biāo)時(shí)，不管重復(fù)次數(shù)如何，都是3位數(shù)字，第一位數(shù)字必須是所有試管都生長(zhǎng)微生物的某一稀釋度的培養(yǎng)試管，后兩位數(shù)字依次為以下兩個(gè)稀釋度的生長(zhǎng)管數(shù)，如果再往下的稀釋仍有生長(zhǎng)管數(shù)，則可將此數(shù)加到前面相鄰的第三位數(shù)上即可。如某一微生物生理群稀釋培養(yǎng)記錄為：

稀釋度

l0-1

10-2

10-3

l0-4

10-5

10-6

重復(fù)數(shù)

4

4

4

4

4

4

出現(xiàn)生長(zhǎng)的管數(shù)

4

4

3

2

1

0

以上情況，可將最后一個(gè)數(shù)字加到前一個(gè)數(shù)字上，即數(shù)量指標(biāo)為“433”，查表得近似值為30，則每毫升原菌液中含活菌30×102個(gè)。按照重復(fù)次數(shù)的不同，最大或然數(shù)表又分為三管最大或然數(shù)表、四管最大或然數(shù)表和五管最大或然數(shù)表。應(yīng)用MPN計(jì)數(shù)，應(yīng)注意兩點(diǎn)，一是菌液稀釋度的選擇要合適，其原則是最低稀釋度的所有重復(fù)都應(yīng)有菌生長(zhǎng)，而最高稀釋度的所有重復(fù)無(wú)菌生長(zhǎng)。對(duì)土壤樣品而言，分析每個(gè)生理群的微生物需5—7個(gè)連續(xù)稀釋液分別接種，微生物類群不同，其起始稀釋度不同(見(jiàn)附表1)；二是每個(gè)接種稀釋度必須有重復(fù)，重復(fù)次數(shù)可根據(jù)需要和條件而定，一般2—5個(gè)重復(fù)，個(gè)別也有采用2個(gè)重復(fù)的，但重復(fù)次數(shù)越多，誤差就會(huì)越小，相對(duì)地說(shuō)結(jié)果就會(huì)越正確。不同的重復(fù)次數(shù)應(yīng)按其相應(yīng)的最大或然數(shù)表計(jì)算結(jié)果。最大或然數(shù)表數(shù)量指標(biāo)管數(shù)近似值復(fù)重3450000.00.00.00010.30.20.2002——0.50.4003——0.7——0100.30.20.20110.60.50.4012——0.70.6013——0.9——0200.60.50.4021——0.70.6022——0.9——030——0.70.6031——0.9——040——0.9——041——1.2——1000.40.30.21010.70.50.41021.00.80.6103——1.00.81100.70.50.41111.10.80.6112——1.10.8113——1.3——1201.10.80.61211.41.10.8122——1.31.0123——1.6——1301.61.10.8131——1.41.0132——1.6——140——1.41.1141——1.7——2000.90.60.52011.40.90.72022.01.20.9203——1.61.22101.50.90.72112.01.30.92123.01.61.2212——2.0——2202.01.30.92213.01.61.22223.52.01.42234.0————2303.01.71.22313.52.01.42324.0————240——2.01.4241——3.0——3002.51.10.83014.01.61.13026.52.01.4303——2.5——3104.51.61.13117.52.01.431211.53.01.731316.03.52.03209.52.01.432115.03.01.732220.03.52.032330.0————33025.