臨床CR檢測(cè)技術(shù)實(shí)習(xí)生講課

臨床PCR技術(shù)KaryB.Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method1930年提出了兩種核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復(fù)制模型。一、PCR概述一、PCR概述（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一種在體外通過重復(fù)DNA合成，以擴(kuò)增特定核苷酸序列的方法。特點(diǎn)高靈敏度高特異性體外進(jìn)行快捷PCR的概念核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴(kuò)增反應(yīng)不需要每一個(gè)循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，PCR技術(shù)成為了分子生物學(xué)中的一項(xiàng)突破性技術(shù)。PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇一、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復(fù)二、實(shí)驗(yàn)步驟（一）核酸提取1.DNA提取100ul濃縮液100ul血清吹打混勻12000g離心5min棄上清20ul提取液100℃煮10min模板二、實(shí)驗(yàn)步驟2.RNA提取10ulA液200ulB液震蕩混勻8000g離心1min200ulDEPC乙醇65℃干燥10minRNA模板8000g離心1min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA棄上清重復(fù)洗2次50ul血清3、細(xì)胞或組織劇烈震蕩400ul試劑1加入400ul試劑2震蕩混勻12000g離心5min完全棄上清加入試劑3模板加樣擴(kuò)增雜交顯色（二省）擴(kuò)腐增HB鄰V引物(1宿68殃bp鞋)：上游襯：5-族GA鉛AG得TG軟TG明AC填GT丘TG品AC蔽AT端CC下游柴：5-只AC華AG晶AG軌TA毒CT靈TG雀CG須CT尾CA泳GG擴(kuò)增胡體系：（50汪μl體系精）10屬*B敗uf久fe怕r聚-雙--膀5μ儲(chǔ)ldN運(yùn)TP聚--弦-1熱μlMg脫Cl2--事-3索μlPr飾im倡er確F價(jià)--厲-2桌μlPr月im埋er輪R扯--綢-2裙μlDN廣A--菌-2備μlTa存q酶--撫-1匹μlH2O府--漢-3伯4μ碑l反應(yīng)扎程序預(yù)變摩性94C紅3m贈(zèng)in循環(huán)延伸72C佳5m街in。注：脂每組岡實(shí)驗(yàn)土陰性孩對(duì)照巨用無衣菌生萬理鹽門水代男替模悄板58C45s72C45s94C45s30循環(huán)（三跑）結(jié)墳果判袖讀（四茶）PC佛R的常旺見問械題及亭處理勾措施常見把問題污染禽：表現(xiàn)辣為陰諒性對(duì)影照同足樣出碎現(xiàn)目皇的條女帶或陰性屠對(duì)照脹出現(xiàn)卷‘S’形曲律線。污染股的來?xiàng)椩矗簛碜栽燮渌頊y(cè)試淚樣品厭的DN鴿A來自庭試驗(yàn)熱材料奸如重沸組克說隆的DN壓A外源DN蜻A污染來自壘同一晶靶序定列前砍一次PC冠R的擴(kuò)茂增產(chǎn)憂物。（三悲）PC嚷R的常肚見問些題及堵處理嘗措施如何噸減少掘污染實(shí)驗(yàn)抽室分財(cái)區(qū)酶法頭控制尿嘧鐵啶DN嶼A糖基樓化酶尊（UN干G)短于10卡0b范p的PC曬R產(chǎn)物騎不能部用UN斯G完全歲消除族污染焦。紫外過線表倚面照在射消除紙?jiān)噭┯?、加驚樣頭匹中的DN斷A污染臟。對(duì)短PC耳R產(chǎn)物女效果饑不好以預(yù)咐防污逐染為蘋主良好甘的實(shí)比驗(yàn)室觀操作三、欺熒光肚定量PC強(qiáng)R（一誕）熒委光PC寶R定量鋼的概阻念以外踐參已訓(xùn)知數(shù)淚量拷潛貝數(shù)昨的標(biāo)材準(zhǔn)品晨為標(biāo)籍準(zhǔn)，掛通過屑擴(kuò)增福及對(duì)砌熒光探值的捕監(jiān)測(cè)煤，對(duì)PC黃R起始必模板暴量的贈(zèng)定量擔(dān)。（二繳）熒妙光定百量PC杯R原理染料煌染色SY腦BR?Gr嗽ee亞n響I溴乙濕錠(E酒th突id曾iu惑m卻Br微om鐘id風(fēng)e)探針伍標(biāo)記Ta捉qM樹anTM分子巨信標(biāo)(M隱ol洋ec科ul羞ar飄b似ea寨co喪ns櫻)Ta練qM扇an探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'（三岸）定勉量PC桌R的數(shù)貿(mào)學(xué)原陵理PC愿R理哲論盾方約程N(yùn)誦=府N0x遭(1騎+E愚)nN:擴(kuò)增布數(shù)量N0:起始煌模板止數(shù)量E：擴(kuò)增寸效率n:循環(huán)祥數(shù)指數(shù)寺期PC呆R定量肥方程塑才有符效Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長(zhǎng)期Linear平臺(tái)期Plateauy=x(1+e)n指數(shù)增長(zhǎng)期GeometricPC飛R曲線線性簽圖譜半對(duì)首數(shù)圖則譜起點(diǎn)傷定量殿與終稅點(diǎn)定撿量起點(diǎn)船定量終點(diǎn)竿定量“加進(jìn)灣不同舟拷貝掘的膜德板”半對(duì)數(shù)圖譜線性圖譜同一咽個(gè)樣睡品重辰復(fù)96次起點(diǎn)旨定量簡(jiǎn)的優(yōu)鞠勢(shì)終點(diǎn)塵產(chǎn)物理數(shù)量猛：誤差盯太大拐點(diǎn)云產(chǎn)物紐奉數(shù)量耀：重丹現(xiàn)性熄好起始DN淋A量，嘗更具營意義重現(xiàn)湊性好耍，誤次差小起點(diǎn)壟定量為的關(guān)納鍵：CT值CT值：械熒光除信號(hào)引有統(tǒng)風(fēng)計(jì)學(xué)宏意義在顯著虜增長(zhǎng)(穿過害閾胞值線)時(shí)的梁循環(huán)俱次數(shù)CT值半對(duì)撿數(shù)圖溝譜CT值線性慌圖譜CT起始DN覆A濃度當(dāng)循索環(huán)次能數(shù)n=代CT值時(shí)凈：RT=卸RB+植X0(1嶺+妄E)CTRslg挽(描RT-眨RB)按=滿lg吃X0+頓CTlg啟(喉1+慣E橫)烈+董lg茶RsCTlg禍(撒1+菌E講)鼻=奏-店lg吼X0+凳lg橋(碑RT-為RB)禽–刷lg騎Rs即CT=毫-我k英lg拆X0+釣b（線性戀方程錢）Rn=辣RB+憐X0(1窩+煉E)nRsCT值-X0作圖CTX0CT=槽-哄k撤lo詢gX0+豪b四、PC轟R檢測(cè)械的臨窩床應(yīng)靈用（一汁）標(biāo)木本采妻集要扎求項(xiàng)目標(biāo)本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標(biāo)本。2.也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標(biāo)本或咽拭子。也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標(biāo)本：留于無菌試管。。3.也可取抗凝血標(biāo)本,但需分離單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)，陽性率才會(huì)高。（于發(fā)熱時(shí)抽取）MP

咽拭子項(xiàng)目標(biāo)本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細(xì)小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應(yīng)略帶粘膜）。前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動(dòng)棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV（二獄）結(jié)鐵果分臘析、走報(bào)告布及解許釋1.定性PC列R與定巨量PC悶R的比聞?shì)^2.定量PC翼R測(cè)定阿的臨巴床意柜義3.定性PC鋤R測(cè)定燒的臨竄床意秩義4.定性拍和定協(xié)量測(cè)猛定的再結(jié)果核報(bào)告而及解災(zāi)釋1.定性PC忠R與定休量PC扒R的比羞較瓊脂困糖凝歸膠電旨泳定量PC椅R擴(kuò)增售曲線降圖2.定量PC深R的臨樹床意縮慧義對(duì)致嬸病微干生物鑒核酸拳含量悉進(jìn)行扔定量沿檢測(cè)彌補(bǔ)處免疫牧檢測(cè)斧的缺主陷縮短橫診斷泡的窗挨口期星（如HB刊V,項(xiàng)HI島V）對(duì)治布療過套程進(jìn)冰行藥縫物療旱效監(jiān)慮測(cè)用于盤基因獅表達(dá)庸方面足的研蠟究某患淘者HB兄V-筆DN蛾A的PC通R結(jié)果肢動(dòng)態(tài)悔圖日期HBV-DNA2004-6-39.3E+72004-12-72.0E+62005-4-191.8E+32005-7-250.0E+03、定仔性測(cè)稀定的肥臨床艇應(yīng)用診斷用于精篩檢耐藥統(tǒng)突變蹤蝶檢測(cè)病毒棒基因商型檢熱測(cè)GG葬A榆G沉GG知A鐵G帆A鮮A織AA4.定性腔和定淋量測(cè)推定的療結(jié)果較報(bào)告朽及解把釋（1）定蠅性陰性陽性（2）定駛量(以我栗科參歇考值注為例)HB土V-六DN彈A<庫10檢0氧I爆U/役ml倍(不同懸項(xiàng)目合數(shù)值證不同)大于星參考娛值，捎在檢擠測(cè)范禾圍之赤內(nèi)，跟是多初少報(bào)超