辣椒堿納米乳注射劑的制備及其體外評價(jià)

辣椒堿納米乳注射劑的制備及其體外評價(jià)辣椒堿納米乳注射劑的制備及其體外評價(jià)

：盧秀霞龍曉英丁鋼袁飛陳金愛陳秋偉張海龍

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辣椒堿納米乳注射劑的制備及其體外評價(jià)

避開網(wǎng)狀內(nèi)皮單核細(xì)胞吞噬系統(tǒng)（MPS）吞噬而延長辣椒堿體內(nèi)作用時(shí)間，改善辣椒堿生物學(xué)性質(zhì)，最終達(dá)到起效快、鎮(zhèn)痛時(shí)間長、副作用低的目的，為擴(kuò)大辣椒堿臨床應(yīng)用供應(yīng)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器

辣椒堿原料（貴州安順生達(dá)生物科技開發(fā)公司，純度≥97%，批號20240503），辣椒堿對比品（SIGMA公司，純度≥97％，批號2069698），中鏈脂肪酸三甘油酯（MCT，德國SasolGermanyGmbH，iv級，批號061224），吐溫80（上海申宇醫(yī)藥有限公司，藥用級，批號080201），豆磷脂（上海金伴藥業(yè)有限公司，藥用級，批號021109），葡聚糖SephadexG50（北京拜爾迪生物公司，批號17004302），丙二醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號071012），色譜甲醇（天津四友化學(xué)試劑廠），超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1納米乳處方篩選

2.1.1納米乳的制備稱取適量的藥物、油、乳化劑、助乳化劑，攪拌混勻，50℃水浴加熱溶解，得勻稱透亮?????的溶液；在磁力攪拌下將此溶液逐滴加入60～65℃蒸餾水中乳化。2.1.2油、表面活性劑種類分別以大豆油、MCT、油酸乙酯為油相，吐溫80、泊洛沙姆F68、豆磷脂為乳化劑，考察外觀及700nm透光率（此波長藥物、輔料自身無汲取，透光率僅與乳滴大小成反比），初步篩選乳劑的組成，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：乳化劑與油的質(zhì)量比為4∶1時(shí)，乳化劑的乳化力量由強(qiáng)到弱排列是：吐溫80＞泊洛沙姆F68＞豆磷脂，故選擇吐溫80為乳化劑；油相被乳化由強(qiáng)到弱排列是：油酸乙酯≈MCT＞大豆油，而MCT已被歐洲藥典準(zhǔn)許用于注射劑，且已有上市產(chǎn)品［12］436-439，故選擇MCT為油相。

表1油相、表面活性劑種類對粒徑的影響（略）

Table1Effectofoilphaseandsurfactantsonparticlesize

2.1.3表面活性劑用量吐溫80與MCT按不同質(zhì)量比，分別以4∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1∶1混合，按“2.1.1”項(xiàng)制備，考察外觀及700nm透光率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：在MCT與丙二醇的量、制備工藝相同前提下，吐溫80∶MCT≥2.5∶1時(shí)能形成微乳。因此，選擇吐溫80∶MCT=2.5∶1作為表面活性劑與油最低比例。

2.1.4復(fù)合乳化劑比例固定（吐溫80+豆磷脂）∶MCT=2.5∶1，將吐溫80與豆磷脂按不同質(zhì)量比混合，考察方法同“2.1.3”項(xiàng)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：當(dāng)吐溫80∶豆磷脂≥2∶1時(shí)能形成微乳。為削減吐溫80的用量，選擇吐溫80∶豆磷脂=2∶1為復(fù)合乳化劑比例。

2.1.5油濃度固定吐溫80∶豆磷脂∶MCT=0.25∶0.125∶0.15，按“2.1.1”項(xiàng)制備，考察MCT不同濃度時(shí)的包封率。由表4可見，辣椒堿納米乳包封率隨MCT濃度的增大而相應(yīng)提高，當(dāng)MCT濃度上

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升至1.50%，包封率為85.22%，符合藥典的相關(guān)規(guī)定（包封率＞80%）。

2.2納米乳制備工藝優(yōu)化

2.2.1乳化溫度選擇將藥物、油、復(fù)合乳化劑、助乳化劑按處方量混勻，50℃水浴加熱溶解，得勻稱透亮?????的溶液，在磁力攪拌下將此溶液分別逐滴加入60～65℃與常溫（25℃）蒸餾水中乳化30min。辣椒堿納米乳包封率結(jié)果見表5。結(jié)果表明：60～65℃乳化的包封率略高于常溫乳化。為簡化生產(chǎn)工藝，選擇常溫（25℃）乳化。

表2油與表面活性劑比例對粒徑的影響（略）

Table2Effectoftheproportionbetweenoilandsurfactantsonparticlesize

表3復(fù)合乳化劑比例對粒徑的影響（略）

Table3Effectoftheproportionofpositeemulsifiersonparticlesize

表4油濃度對辣椒堿納米乳包封率的影響（略）

Table4Effectofoilconcentrationonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion

2.2.2油、水滴加挨次將藥物、油、復(fù)合乳化劑、助乳化劑按“2.2.1”項(xiàng)制備勻稱透亮?????的溶液，在磁力攪拌下，分別將此溶液逐滴加入25℃蒸餾水中，以及將25℃蒸餾水一次傾入該溶液中乳化30min，包封率結(jié)果見表6。結(jié)果表明：油、水滴加挨次對包封率影響不大?？紤]今后工業(yè)生產(chǎn)更簡潔，選擇蒸餾水一次傾入油中乳化的方式。表5溫度對辣椒堿納米乳包封率影響（略）

Table5Effectoftemperatureonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion

表6制備工藝對辣椒堿納米乳包封率影響（略）

Table6Effectofpreparationtechnologyonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion

2.3辣椒堿納米乳注射劑的制備

依據(jù)辣椒堿納米乳處方設(shè)計(jì)與工藝討論結(jié)果，結(jié)合注射劑的制備工藝，擬定辣椒堿納米乳注射劑制備工藝如下：按處方量稱取辣椒堿、油、乳化劑、助乳化劑，50℃水浴加熱溶解，得勻稱透亮?????的溶液；在磁力攪拌下，將常溫蒸餾水（0.22μm濾過滅菌）傾入該溶液乳化30min，形成淡黃色、澄清透亮?????的辣椒堿納米乳。于干凈環(huán)境下，0.22μm微孔濾膜過濾辣椒堿納米乳，將續(xù)濾液灌裝在已滅菌的2mL、5mL安瓿中，拉封。將灌封好的辣椒堿納米乳注射劑121℃、0.1MPa熱壓滅菌15min，即得。

2.4形態(tài)與粒徑測定

2.4.1形態(tài)測定取適量辣椒堿納米乳，滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜止10min后用濾紙片吸干，滴加1～3％磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染5min，自然揮干，用透射電子顯微鏡觀看并拍攝照片，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明:納米乳劑中的乳滴呈類球形，粒徑分布勻稱。

圖1辣椒堿納米乳透射電鏡照片(×50000)（略）

Figure1Transmissionelectronphotographofcap

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saicinnanoemulsion(×50000)

2.4.2粒徑大小與分布測定取辣椒堿納米乳適量，采納動(dòng)態(tài)光散射（dynamiclightscattering,DLS）原理的Nip380/ZLS激光粒度/動(dòng)電位分析儀測定，其粒徑與粒度分布見圖2。結(jié)果表明：辣椒堿納米乳的平均粒徑6.16nm，多分散系數(shù)0.307，粒度分布勻稱。

圖2辣椒堿納米乳粒徑分布圖（略）

Figure2Particlesizedistributionofcapsaicinnanoemulsion

2.5動(dòng)電位測定

測定3批辣椒堿納米乳的pH值，每批測定3次，取平均值。3批乳劑的pH值分別為5.45、5.43、5.45，符合靜脈注射劑對pH值的要求。

圖3辣椒堿納米乳動(dòng)電位分布圖

Figure2Zetapotentialmicroscopedistributionofcapsaicinnanoemulsion

2.7辣椒堿納米乳含量測定

2.7.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

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sp;色譜柱為DiamonsilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流淌相為甲醇水磷酸（體積比70∶30∶0.1）；熒光檢測波長為λex=283nm,λem=310nm；流速為1.0mL·min-1；進(jìn)樣量為20μL。辣椒堿保留時(shí)間12.3min，理論塔板數(shù)4156，拖尾因子1.13，峰形對稱，色譜圖見圖4A。

2.7.2樣品溶液的制備精密稱取0.10mg辣椒堿對比品，無水乙醇溶解并定容至10mL，取該液1.0mL，無水乙醇稀釋至10mL，搖勻，制得1.0μg/mL辣椒堿對比液。精密量取0.004%辣椒堿納米乳0.30mL（約相當(dāng)于辣椒堿12μg），無水乙醇溶解并定容至10mL，超聲混勻，制得1.2μg/mL辣椒堿供試液。精密量取不含辣椒堿的空白納米乳0.30mL，同法制得陰性對比液。

2.7.3方法專屬性考察分別量取對比液、供試液及陰性對比液20μL，按上述色譜條件測定，結(jié)果表明，空白基質(zhì)無干擾，且供試液與對比液保留時(shí)間基本全都，見圖4。

圖43種樣品溶液熒光HPLC圖（略）

Figure4FluorescenceHPLCofthreesamples

2.7.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取辣椒堿對比品0.20mg于10mL容量瓶中，無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得20μg/mL辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密吸取該儲備液0.1、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0mL置10mL容量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列濃度對比液。分別進(jìn)樣20μL，按上述色譜條件測定，以對比液質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：A=4×106ρ-224614，r=0.9997，結(jié)果表明辣椒堿在0.20～

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6.00μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以信噪比（S/N）＝3計(jì)算，測得辣椒堿最低檢測限為0.1ng。

2.7.5精密度試驗(yàn)取0.1μg/mL辣椒堿對比液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得平均峰面積為10012711，RSD為0.54%，表明儀器精密度良好。

2.7.6重現(xiàn)性試驗(yàn)按上述方法制備濃度為0.8、1.0、2.0、4.0、6.0μg/mL的辣椒堿供試液，各3份，以1.0μg/mL辣椒堿對比液的峰面積定量，結(jié)果各濃度辣椒堿含量平均值為91.10%、94.94%、91.03%、91.01%、90.04%；RSD（n=3）為0.37%、0.85%、0.25%、0.42%、1.7%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.7.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試液適量，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24h后按色譜條件測定，測得峰面積日內(nèi)RSD為0.32%（n=7），表明供試液在24h內(nèi)穩(wěn)定。每天測1次，連續(xù)測5d，峰面積日間RSD為1.5%（n=5）。

2.7.8回收率試驗(yàn)精密量取0.50mL空白納米乳15份，分3組，置10mL容量瓶中，分別加入20μg/mL辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.40、0.50、1.00mL，各5份，無水乙醇定容，超聲混勻，0.45μm濾過，精密吸取續(xù)濾液20μL按上述色譜條件測定，外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果高、中、低濃度平均回收率分別為100.14%、102.56%、107.25%，RSD值分別為1.30%、0.83%、0.58%（n＝5），見表7。

2.7.9含量測定精密量取0.004%辣椒堿納米乳0.50mL，無水乙醇溶解并定容至10mL，超聲混勻，得辣椒堿供試液；另精密稱取辣椒堿對比品適量，無水乙醇配成2.0μ

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g/mL辣椒堿對比液。分別吸取辣椒堿供試液、對比液20μL，按上述色譜條件測定，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3個(gè)批號辣椒堿含量分別為94.50%、94.55%和94.10%。

表7辣椒堿納米乳回收率（略）

Table7Recoveryofcapsaicinnanoemulsion

2.8辣椒堿納米乳包封率測定

式中ρ總藥表示辣椒堿總質(zhì)量濃度，ρ包封表示納米乳中被包封辣椒堿質(zhì)量濃度。測得3批辣椒堿納米乳的包封率分別為85.83%、84.50%、85.34%，RSD為0.79%。見表8。

表8辣椒堿納米乳包封率（略）

Table8Entrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion

3爭論

3.1影響乳滴粒徑因素

3.1.1油、表面活性劑種類油、表面活性劑種類是影響乳滴粒徑的重要因素。依據(jù)納米乳形成機(jī)理，當(dāng)表面活

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性劑的親水親油平衡值（HLB）與油所需HLB值相當(dāng)時(shí)，形成納米乳較穩(wěn)定［14］。當(dāng)油、表面活性劑濃度不變，分別以大豆油、油酸乙酯、MCT為油相，形成乳滴粒徑由小到大排列：吐溫80＜泊洛沙姆F68＜豆