生物課件（蘇教版）第十單元解惑練4PCR技術(shù)拓展應(yīng)用

解惑練4PCR技術(shù)拓展應(yīng)用應(yīng)用1：反向PCR測(cè)定未知DNA區(qū)域當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，可采用反向PCR技術(shù)。原理：用限制性內(nèi)切核酸酶切割該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)相反方向的特異性引物，該引物對(duì)已知序列反向，但對(duì)未知序列卻是相向的，從而得以擴(kuò)增出未知序列。應(yīng)用2：PCR定點(diǎn)突變技術(shù)該技術(shù)要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點(diǎn))是可以互補(bǔ)的。因此，分別利用引物1和2，引物3和4進(jìn)行PCR后，得到的DNA片段可以通過(guò)引物2和3互補(bǔ)的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段。通過(guò)測(cè)序可以檢驗(yàn)定點(diǎn)突變是否成功。應(yīng)用3：(實(shí)時(shí))熒光定量PCR(RT－PCR)先從樣本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同時(shí)也存在很多采樣患者的組織和存在于采樣部位的微生物的RNA。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶將樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)體系中，包含一對(duì)特異性引物以及一個(gè)Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；若反應(yīng)體系存在靶序列，PCR反應(yīng)時(shí)探針與模板結(jié)合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測(cè)出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高，Ct值越小(如圖)。1.如圖所示，在一段未知序列的突變體DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想對(duì)T－DNA兩側(cè)的未知序列進(jìn)行測(cè)序，下列做法正確的是跟蹤訓(xùn)練A.用引物①和引物④直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后再測(cè)序B.用引物②和引物③直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后再測(cè)序C.用DNA連接酶連接成環(huán)狀后，再用引物①④PCR擴(kuò)增后測(cè)序D.用DNA連接酶連接成環(huán)狀后，再用引物②③PCR擴(kuò)增后測(cè)序√跟蹤訓(xùn)練用引物②和引物③可實(shí)現(xiàn)對(duì)已知的T－DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，但達(dá)不到預(yù)期目的，B、D錯(cuò)誤；用DNA連接酶連接成環(huán)狀后，用引物①④PCR擴(kuò)增后測(cè)序，恰好可擴(kuò)增出T－DNA兩側(cè)的未知序列，C正確。直接選用引物①、④組合進(jìn)行PCR，引物選擇方向相反，無(wú)法完成擴(kuò)增，A錯(cuò)誤；跟蹤訓(xùn)練2.重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，獲得想要的目的基因。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因的特定位點(diǎn)引入特定突變，以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變，原理如圖。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是跟蹤訓(xùn)練A.過(guò)程②需要含Mg2＋的緩沖液、DNA

模板、引物、4種脫氧核苷三磷酸、

熱穩(wěn)定的DNA聚合酶等B.若引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和

引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均

進(jìn)行一次DNA分子的復(fù)制后，一共

會(huì)產(chǎn)生2種DNA分子C.經(jīng)過(guò)程④獲得的雜交DNA有2種，其中只有一種可以經(jīng)過(guò)程⑤獲得目

的基因D.過(guò)程⑤使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶延伸，不需要引物√跟蹤訓(xùn)練過(guò)程②為PCR反應(yīng)，需要在添加了Mg2＋的緩沖液中才能進(jìn)行，需要提供模板DNA、分別與兩條模板鏈結(jié)合的引物、4種脫氧核苷三磷酸和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶等，A正確；兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中各自形成兩種DNA分子，但由于引物1和引物4形成兩個(gè)與原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA屬于同一種DNA，故總共形成3種DNA分子，B錯(cuò)誤；跟蹤訓(xùn)練過(guò)程④獲得的雜交DNA有2種，一種3′端為單鏈，一種5′端為單鏈，5′端為單鏈的雜交DNA為所需DNA，C正確；過(guò)程⑤是延伸過(guò)程，該過(guò)程使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行催化，不需要引物，D正確。跟蹤訓(xùn)練3.(2023·江蘇泗洪縣高三檢測(cè))基因定點(diǎn)突變是指按照特定的要求，使基因的特定序列發(fā)生插入、刪除、置換、重排等變異。右圖甲是一種PCR介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變示意圖，圖乙是研究人員利用基因M1構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變的PCR反應(yīng)體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還需要加入_______________________________；圖甲所示的基因定點(diǎn)突變技術(shù)需要____次PCR；獲得產(chǎn)物A需要的引物是_______________。Taq酶、dNTP(緩沖液、Mg2＋)等3′引物1和引物3跟蹤訓(xùn)練進(jìn)行基因定點(diǎn)突變的PCR反應(yīng)體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還需要加入Taq酶、dNTP(緩沖液、Mg2＋)等。從圖甲可以看到，從加入引物到獲得基因M1總共經(jīng)歷了3次PCR。產(chǎn)物A的兩端互補(bǔ)的引物是引物1和3。跟蹤訓(xùn)練(2)研究人員對(duì)PCR的中間產(chǎn)物A、B進(jìn)行純化后，利用圖中相關(guān)酶對(duì)基因M和產(chǎn)物A、B進(jìn)行充分酶切后得到不同的片段，長(zhǎng)度(kb)如下表，則圖中基因敲除片段的長(zhǎng)度為_(kāi)_______，基因M1的長(zhǎng)度為_(kāi)_______。項(xiàng)目基因MAB長(zhǎng)度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.050.23kb6.09kb跟蹤訓(xùn)練基因M上有3個(gè)酶切位點(diǎn)(箭頭處)，完全酶切產(chǎn)生4個(gè)片段，分別為3.24kb、2.8kb、0.15kb、0.13kb，共6.32kb，A片段酶切后產(chǎn)生2個(gè)片段，分別為2.8kb、0.09kb，B片段酶切后產(chǎn)生2個(gè)片段，分別為3.24kb、0.05kb，圖中A片段和B片段的“……”是相同的，因此“……”處為0.05kb，則基因M1的長(zhǎng)度為＋＋＝6.09(kb)，因此基因敲除片段的長(zhǎng)度為－＝0.23(kb)。跟蹤訓(xùn)練(3)通過(guò)圖甲過(guò)程獲得的基因M1仍需要大量擴(kuò)增，此時(shí)選擇的引物是______________，為了與圖乙中的Ti質(zhì)粒相連，還需要分別在它們的____端引入限制酶_______________________________________的識(shí)別序列。引物1和引物25HindⅢ、PstⅠ(順序應(yīng)與前面的引物對(duì)應(yīng))跟蹤訓(xùn)練獲得基因M1后，與M1兩條鏈兩端互補(bǔ)的引物是引物1和引物2。由于質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，切割后會(huì)出現(xiàn)不同的黏性末端，而基因M1兩端沒(méi)有能與黏性末端互補(bǔ)的序列，故需要分別在基因兩條鏈的5′端引入限制酶的識(shí)別序列，根據(jù)基因M1插入質(zhì)粒的位置可知，添加的是限制酶HindⅢ、PstⅠ的識(shí)別序列。跟蹤訓(xùn)練(4)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，M1基因必需插入到Ti質(zhì)粒的_________中，原因是_______________________________________________________。T－DNATi質(zhì)粒上的T－DNA能夠轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞的染色體上跟蹤訓(xùn)練4.“實(shí)時(shí)熒光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2h內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果。Taqman探針是實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR技術(shù)中的一種常用探針(如圖1)，其5′端連接熒光基團(tuán)(R)，3′端連接淬滅劑(Q)。當(dāng)探針完整時(shí)，R發(fā)出的熒光跟蹤訓(xùn)練(1)結(jié)合圖1和圖2分析，“熒光RT—PCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有________酶、______酶、Taqman探針、引物、dNTP、Mg2＋、緩沖劑等。這種分子層面的熒光RT—PCR檢測(cè)具有特異性和靈敏性都很高的特點(diǎn)，主要與試劑盒中的______、____________有關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄Taq引物Taqman探針跟蹤訓(xùn)練圖1和圖2所示新冠檢測(cè)的基本原理：將新冠病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，因此熒光PCR法所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有逆(反)轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、Taqman探針、引物、dNTP、Mg2＋、緩沖劑等。試劑盒中的引物和Taqman探針決定了這種分子層面的熒光RT—PCR檢測(cè)具有特異性和高靈敏性。跟蹤訓(xùn)練(2)根據(jù)Taqman探針功能分析，探針中堿基序列的設(shè)計(jì)應(yīng)主要依據(jù)______________________________________________________________________。新冠病毒是冠狀病毒大家庭中新的一員，其堿基序列與引起SARS的冠狀病毒堿基序列有79.5%的相似性，新冠病毒RNA內(nèi)部的一段序列(或新冠病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA的部分序列)與流感病毒堿基相似度也較高，因此在設(shè)計(jì)Taqman探針時(shí)應(yīng)篩選出該病毒特有的序列，以避免________(填“假陰性”或“假陽(yáng)性”)的出現(xiàn)。假陽(yáng)性跟蹤訓(xùn)練(3)根據(jù)圖1和圖2，Taq酶除了能催化DNA子鏈的延伸，還能________________________________。催化RNA(Taqman探針)的水解根據(jù)圖1和圖2可知，Taq酶除了能催化DNA子鏈的延伸，還能催化RNA(Taqman探針)的水解，Taqman探針?biāo)忉尫懦鲇坞xR被儀器檢測(cè)到。跟蹤訓(xùn)練(4)若每分子探針?biāo)忉尫诺腞基團(tuán)熒光強(qiáng)度為定值a，則反應(yīng)體系中某時(shí)刻熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn)主要與___________、_____________________________________________有關(guān)。在檢測(cè)過(guò)程中，隨著PCR的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，“雜交雙鏈”熒光信號(hào)的強(qiáng)度也等比例增加，增加了檢測(cè)結(jié)擴(kuò)增次數(shù)樣品中病毒初始數(shù)量(或病毒樣品模板RNA含量)果的準(zhǔn)確性，一般要達(dá)到或超過(guò)閾值時(shí)才確診。可通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)生量的變化從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖(如圖3)?！捌脚_(tái)期”出現(xiàn)的最可能的原因是試劑盒中_____________________________________________等有限，原料、引物和探針數(shù)量(或TaqDNA聚合酶活性)超出一定的循環(huán)數(shù)后，熒光標(biāo)記的“雜交雙鏈”不再增加。跟蹤訓(xùn)練在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，Taq酶遇到探針時(shí)會(huì)使探針?biāo)舛尫懦鲇坞x的R，因此，擴(kuò)增次數(shù)越多，樣品中病毒初始數(shù)量(病毒樣品模板RNA含量)越多，則被水解的探針越多，釋放出游離的R越多，反應(yīng)體系中某時(shí)刻熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn)也越強(qiáng)。由圖3可知，隨著PCR的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，“雜交雙鏈”熒光信號(hào)的強(qiáng)度也等比例增加，超出一定的循環(huán)數(shù)后，熒光標(biāo)記的“雜交雙鏈”不再增加，其原因最可能是試劑盒中原料、引物和探針數(shù)量(Taq酶活性)等有限。跟蹤訓(xùn)練(5)雖然熒光RT—PCR是當(dāng)前被廣泛認(rèn)可的檢測(cè)手段之一，但是不斷有“假陰性”現(xiàn)象報(bào)道