單克隆抗體的制備-課件

單克隆抗體的制備廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科廖偉嬌一、單克隆抗體概念：每一克隆B細胞所產生的理化性狀高度均一、組成均一、只與同一種抗原決定族反應的抗體，稱為單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）。二、雜交瘤技術制備單克隆抗體流程動物免疫分離脾細胞制備骨髓瘤細胞細胞融合HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤細胞陽性孔克隆化并擴大培養(yǎng)再次克隆克隆擴大培養(yǎng)擴大培養(yǎng)收集上清液動物接種收集腹水單克隆抗體純化保存ELISA測血清三、單克隆抗體的基本技術1.抗原提純與動物免疫：抗原純度高：電泳純與骨髓瘤細胞同源的BALB/c小鼠2.細胞的選擇：A經過抗原免疫的B細胞（脾細胞）。B腫瘤細胞(多發(fā)性骨髓瘤細胞:Sp2/0）。3.細胞融合：融合劑：聚乙二醇(PEG,常用聚合度1000~2000濃度w/v：40%)細胞比例：1:2~1:10，常用1:4。反應時間：2~4min。4.培養(yǎng)基的選擇：HAT培養(yǎng)基。含有三種關鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).5.細胞的DNA合成一般有兩條途徑：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與反應。B：在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，經次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。6.HAT培養(yǎng)基的選擇原理：⑴氨甲蝶呤(A)是葉酸拮抗劑，可阻斷細胞利用正常途徑合成DNA，細胞在含有氨甲蝶呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DNA。⑵瘤細胞是HGPRT酶陰性細胞，自身不能通過替代途徑合成DNA而繁殖。⑶B細胞雖含有HGPRT，但不能在體外培養(yǎng)存活（只存活5~7d，且功能下降)。⑷融合細胞含有B細胞和瘤細胞，其中瘤細胞核利用B細胞的HGPRT酶進行旁路合成DNA而存活。7.克隆化并擴大培養(yǎng)(單細胞培養(yǎng)稱為克隆化)：⑴有限稀釋法:將細胞懸液逐次稀釋后加入培養(yǎng)孔(36%的孔為1個細胞/孔)，可獲得單個細胞形成的克隆，選擇高分泌抗體的細胞株擴大培養(yǎng)或凍存。⑵顯微操作法：在倒置顯微鏡下吸出單個細胞培養(yǎng)。⑶軟瓊脂平板法：下飼養(yǎng)/上融合C,分層培養(yǎng)后用⑵法⑷細胞分選儀法：流式細胞儀分選。8.單克隆抗體的制備、純化：A體外細胞株擴大培養(yǎng)，取上清液提純。B接種小鼠腹腔，取腹水提純。C純化按抗體純化步驟進行。9.細胞株凍存和復蘇：加小牛血清或1640培養(yǎng)液配成終濃度10%的二甲亞砜(DMSO)凍存液后液氮(-196℃)保存。原則是：慢凍(逐步降溫，以每分鐘降1℃為宜)，快融(立即浸入37~40℃水浴)。10.注意事項：⑴用降植烷(pristane)等油類制劑，反復注入BALB/C小鼠腹強腔，可誘發(fā)產生小鼠骨髓瘤細胞。這種細胞在適宜培養(yǎng)條件下，具有無限繁殖能力，選擇本身不會產生Ig(SP2/O和小鼠骨髓瘤653細胞株)的對數期生長細胞作為融合細胞。⑵選擇缺乏HGPRT或TK的細胞：A采用毒性藥物8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine,8-AG)選育出缺乏HGPRT的細胞(因為缺乏HGPRT+細胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT+細胞才能存活），培養(yǎng)過程中有個別細胞出現返祖現象，故應定期用15~20ug/ml的8-AG處理細胞。B或利用5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BudR)誘發(fā)缺乏TK的細胞。一般選育缺乏TK的細胞較困難。⑶采用飼養(yǎng)細胞：在體外培養(yǎng)條件下，單個或少數分散的細胞不易順利生長繁殖。當加入一定量的其他活細胞后，?？纱龠M原有細胞的繁殖，這種加入的細胞即稱為飼養(yǎng)細胞，可用普通小鼠脾細胞/腹腔細胞/胸腺細胞、大鼠和豚鼠的腹腔細胞，最常用普通小鼠腹腔細胞。三、報單克翅隆抗辱體的分應用肆：1.院診斷魚(檢可測)貍試劑借：病陣原體袍、腫冠瘤標患志物陽、細倆胞表歉面標激志等2.步治療竹：A移植削物受杜者使歸用T細胞火的Mc議Ab，可預防激急性頭排斥幸反應少。B供體維骨髓巴在體曲外經T細胞瓦的Mc慈Ab處理絞，可笨減輕周或消賄除移事植物含抗宿鼠主反鵲應。C稠AI馳DS治療D腫瘤徹介入養(yǎng)治療制：細滅胞毒丘劑(寶藥物致)與摧抗腫忠瘤抗稱原的Mc艦Ab結合