單克隆抗體的制備-課件

單克隆抗體的制備廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科廖偉嬌一、單克隆抗體概念：每一克隆B細(xì)胞所產(chǎn)生的理化性狀高度均一、組成均一、只與同一種抗原決定族反應(yīng)的抗體，稱為單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）。二、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體流程動(dòng)物免疫分離脾細(xì)胞制備骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞陽性孔克隆化并擴(kuò)大培養(yǎng)再次克隆克隆擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)收集上清液動(dòng)物接種收集腹水單克隆抗體純化保存ELISA測(cè)血清三、單克隆抗體的基本技術(shù)1.抗原提純與動(dòng)物免疫：抗原純度高：電泳純與骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c小鼠2.細(xì)胞的選擇：A經(jīng)過抗原免疫的B細(xì)胞（脾細(xì)胞）。B腫瘤細(xì)胞(多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞:Sp2/0）。3.細(xì)胞融合：融合劑：聚乙二醇(PEG,常用聚合度1000~2000濃度w/v：40%)細(xì)胞比例：1:2~1:10，常用1:4。反應(yīng)時(shí)間：2~4min。4.培養(yǎng)基的選擇：HAT培養(yǎng)基。含有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).5.細(xì)胞的DNA合成一般有兩條途徑：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與反應(yīng)。B：在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。6.HAT培養(yǎng)基的選擇原理：⑴氨甲蝶呤(A)是葉酸拮抗劑，可阻斷細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，細(xì)胞在含有氨甲蝶呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DNA。⑵瘤細(xì)胞是HGPRT酶陰性細(xì)胞，自身不能通過替代途徑合成DNA而繁殖。⑶B細(xì)胞雖含有HGPRT，但不能在體外培養(yǎng)存活（只存活5~7d，且功能下降)。⑷融合細(xì)胞含有B細(xì)胞和瘤細(xì)胞，其中瘤細(xì)胞核利用B細(xì)胞的HGPRT酶進(jìn)行旁路合成DNA而存活。7.克隆化并擴(kuò)大培養(yǎng)(單細(xì)胞培養(yǎng)稱為克隆化)：⑴有限稀釋法:將細(xì)胞懸液逐次稀釋后加入培養(yǎng)孔(36%的孔為1個(gè)細(xì)胞/孔)，可獲得單個(gè)細(xì)胞形成的克隆，選擇高分泌抗體的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。⑵顯微操作法：在倒置顯微鏡下吸出單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)。⑶軟瓊脂平板法：下飼養(yǎng)/上融合C,分層培養(yǎng)后用⑵法⑷細(xì)胞分選儀法：流式細(xì)胞儀分選。8.單克隆抗體的制備、純化：A體外細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，取上清液提純。B接種小鼠腹腔，取腹水提純。C純化按抗體純化步驟進(jìn)行。9.細(xì)胞株凍存和復(fù)蘇：加小牛血清或1640培養(yǎng)液配成終濃度10%的二甲亞砜(DMSO)凍存液后液氮(-196℃)保存。原則是：慢凍(逐步降溫，以每分鐘降1℃為宜)，快融(立即浸入37~40℃水浴)。10.注意事項(xiàng)：⑴用降植烷(pristane)等油類制劑，反復(fù)注入BALB/C小鼠腹強(qiáng)腔，可誘發(fā)產(chǎn)生小鼠骨髓瘤細(xì)胞。這種細(xì)胞在適宜培養(yǎng)條件下，具有無限繁殖能力，選擇本身不會(huì)產(chǎn)生Ig(SP2/O和小鼠骨髓瘤653細(xì)胞株)的對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞作為融合細(xì)胞。⑵選擇缺乏HGPRT或TK的細(xì)胞：A采用毒性藥物8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine,8-AG)選育出缺乏HGPRT的細(xì)胞(因?yàn)槿狈GPRT+細(xì)胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT+細(xì)胞才能存活），培養(yǎng)過程中有個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，故應(yīng)定期用15~20ug/ml的8-AG處理細(xì)胞。B或利用5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BudR)誘發(fā)缺乏TK的細(xì)胞。一般選育缺乏TK的細(xì)胞較困難。⑶采用飼養(yǎng)細(xì)胞：在體外培養(yǎng)條件下，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易順利生長繁殖。當(dāng)加入一定量的其他活細(xì)胞后，?？纱龠M(jìn)原有細(xì)胞的繁殖，這種加入的細(xì)胞即稱為飼養(yǎng)細(xì)胞，可用普通小鼠脾細(xì)胞/腹腔細(xì)胞/胸腺細(xì)胞、大鼠和豚鼠的腹腔細(xì)胞，最常用普通小鼠腹腔細(xì)胞。三、報(bào)單克翅隆抗辱體的分應(yīng)用肆：1.院診斷魚(檢可測(cè))貍試劑借：病陣原體袍、腫冠瘤標(biāo)患志物陽、細(xì)倆胞表歉面標(biāo)激志等2.步治療竹：A移植削物受杜者使歸用T細(xì)胞火的Mc議Ab，可預(yù)防激急性頭排斥幸反應(yīng)少。B供體維骨髓巴在體曲外經(jīng)T細(xì)胞瓦的Mc慈Ab處理絞，可笨減輕周或消賄除移事植物含抗宿鼠主反鵲應(yīng)。C稠AI馳DS治療D腫瘤徹介入養(yǎng)治療制：細(xì)滅胞毒丘劑(寶藥物致)與摧抗腫忠瘤抗稱原的Mc艦Ab結(jié)合