分子標記-SNP課件

分子標記

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SNP=SingleNucleotidePolymorphism

單核苷酸多態(tài)性基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A,T,C,G)的變異而引起的多態(tài)性一般而言,SNP在群體中發(fā)生頻率不小于1%從理論上來看每一個SNP位點都可以有4種不同的變異形式,包括轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失，但通常發(fā)生的只有兩種,即轉(zhuǎn)換和顛換,二者之比為2:1

A

GG

CTA

G

AATT

C

C

ATTC

G

AGTCA

GG

CTA

G

AATTG

C

ATTC

G

A

GTC在人類基因組中，CpG二核苷酸的胞嘧啶是最易發(fā)生突變的位點,其中大多數(shù)是甲基化的,可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶（C→T）一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，多個核苷酸的變化，即SNPs在描述SNPs時，當前的一致意見是用術(shù)語haplotype（單體型）代替術(shù)語allele（等位基因）位于一條染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點，被稱作單體型對于所有那些在某一位點是A而不是G的人來說，該位點周圍染色體區(qū)域上的SNPs狀況很可能是一致的。這些變異連鎖的區(qū)域就是單體型例

SNP的特點位點豐富

SNP是基因組中分布最廣泛而穩(wěn)定的點突變，在人類基因組中大概每1000

個堿基就至少有一個SNP,人類基因組上的SNP總量可達300萬個甚至更多具有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP

有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達水平,因此它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素遺傳穩(wěn)定性與微衛(wèi)星等重復序列多態(tài)標記相比,SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性，因為SNP

是基于單核苷酸的突變，所以其突變率低易實現(xiàn)分析的自動化

SNP

與傳統(tǒng)分子標記方法存在明顯不同，不再以DNA長度差異作為檢測手段，而是直接檢測序列變化，從而擺脫凝膠電泳的瓶頸限制，實現(xiàn)高效檢測

SNP的分類根據(jù)SNP在基因組分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNP(cSNP)總的來說,cSNP比較少,因為在外顯子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的1/5,但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義,因此倍受關(guān)注根據(jù)對遺傳性狀的影響,cSNP又可分為兩種

同義cSNP

即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的氨基酸序列,突變堿基與未突變堿基的“含義”相同非同義cSNP

堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變,可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能基因周邊SNP(pSNP）基因間SNP(iSNP）基因非編碼區(qū)SNP

大多數(shù)SNP

位于基因組的非編碼區(qū)，它們對個體表現(xiàn)型是無意義的，但對群體而言，這些SNP作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化中卻有很大作用

SNP的檢測SNP檢測技術(shù)按研究對象主要分為兩大類未知單核苷酸突變位點的檢測技術(shù)溫度梯度凝膠電泳（TGGE）通過溫度的變化，使點突變或正常的DNA片段由于氫鍵不穩(wěn)定，造成TM值不同而表現(xiàn)出不同的解鏈行為。作為一種常用的檢測SNP的強有力的工具，TGGE可分析長度在200~900bp內(nèi)的雙鏈DNA片段，但如果在GC富集區(qū)，則SNP檢出率則大大下降

Taqman技術(shù)PCR

反應時，加入一對兩端有不同熒光標記的特異探針來識別不同的等位基因（allele1和allele2），5’端為報告熒光基團（reporter），3’端為淬滅熒光基團(quencher)

PCR過程中，兩個探針能與正向引物和反向引物之間的互補序列特異退火結(jié)合。當探針以完整形式存在時，由于能量共振轉(zhuǎn)移，熒光基團只發(fā)出微弱熒光特異的探針與相應的等位基因雜合后，DNA聚合酶發(fā)揮5’到3’外切酶活性，把報告熒光基團切割下來，脫離了3’端淬滅熒光基團的淬滅作用(quench)，從而發(fā)出熒光兩個探針的5’端標有不同的熒光(FAM或VIC)，3’端標有MGB淬滅基團結(jié)合體。根據(jù)檢測到的不同熒光，可以判斷相應的樣本的SNP等位基因型

技術(shù)路線圖

MultiplexSNaPshot-多重單堿基延伸技術(shù)在一個含有測序酶，四種熒光標記的ddNTP,緊挨多態(tài)位點5’端的不同長度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應體系中，引物延伸一個堿基即終止經(jīng)ABI測序儀跑膠后，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型根據(jù)峰移動的膠位置確定該延伸產(chǎn)物對應的SNP位點對于PCR產(chǎn)物模板可通過多重PCR反應體系來獲得技術(shù)路線圖該技術(shù)的優(yōu)勢分型準確：該技術(shù)也稱小測序技術(shù)，其準確度僅亞于直接測序。多位點同時檢測：可以同時檢測達12個位點，而Taqman一次僅能檢測一個不受SNP位點多態(tài)特性限制：不管該位點是G/C,A/T,G/A,C/T還是插入/缺失多態(tài)，都可以放在一個體系中檢測不受樣本量的限制：而Taqman對少量樣本不適合可以檢測出受污染的樣本：如果一個樣本的分型峰譜偏離正常的分布，它可以提示該樣本可能受到污染或濃度過低，而其它分型方法則不能做到這一點變性梯度凝膠電泳（DGGE）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）變性的高效液相色譜法（DHPLC）毛細管電泳（CE）基因芯片技術(shù)(Genechip）已知單核苷酸突變位點的檢測技術(shù)限制性內(nèi)切酶酶切片斷長度多態(tài)分析（RFLP）有些SNP多態(tài)位點正好處于限制性內(nèi)切酶的識別位點處，其中一種多態(tài)對應的PCR擴增片斷能夠被相應的內(nèi)切酶切動，而另一種卻不能，因此通過對酶切后的PCR產(chǎn)物電泳后的片斷長度分析可知檢測樣本在該位點處的基因型如果檢測SNP位點不存在合適的酶切位點，往往可以通過在PCR引物3’端改變個別堿基引入限制性內(nèi)切酶酶切位點，通過這種引物修飾法可以實現(xiàn)絕大多數(shù)SNP位點的分型都能用RFLP分析來實現(xiàn)技術(shù)路線圖方法特點

優(yōu)點該技術(shù)方法簡單，不需要特殊昂貴設(shè)備，而且能較快定購到實驗所需試劑，實驗前期準備時間短；如果所用的限制性內(nèi)切酶正好是普通常用酶，在一定樣本量的前提下，檢測成本比較低；缺點該方法費時費力，部分位點可能需要較長時間來優(yōu)化；酶切不完全會嚴重降低檢測準確率。等位基因特異性PCR(AS-PCR)AS-PCR

技術(shù)主要是依賴引物的設(shè)計及優(yōu)化PCR反應條件，根據(jù)基因SNP

位點設(shè)計引物，使引物最后一個堿基與突變位點互補，使得只有完全互補的序列才能擴增，因此只需根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無來判定結(jié)果近來研究發(fā)現(xiàn)錯配的3’末端仍可以低于正常配對末端的速度延伸，干擾判定結(jié)果。改進的方法是在引物人為引入錯配堿基、降低3’末端特異性堿基不匹配的擴增產(chǎn)物，不影響或較小影響完全匹配的特異性產(chǎn)物的生成。引入長度差異性引物和雙向等位特異PCR

是近年來常用的方法。等位基因特異寡核苷酸片段分析（ASO）突變錯配擴增檢驗（MAMA）SNP的應用遺傳圖譜的構(gòu)建在許多物種中發(fā)現(xiàn)、收集與鑒定的SNPs已經(jīng)構(gòu)成了龐大的序列變異數(shù)據(jù)庫,極大地促進了遺傳圖譜的構(gòu)建工作,使得原來冗長乏味的事情變得輕松而有趣用SNP標記還有助于將遺傳圖譜和物理圖譜進行進一步的整合DNA指紋的確立作為一種新型的DNA指紋,SNPs標記在物種鑒定、物種起源與親緣關(guān)系、遺傳育種等領(lǐng)域得到了廣泛的應用

SNPs指紋在區(qū)分近緣種的研究中非常有效。群體遺傳和連鎖不平衡群體遺傳學研究群體的基因庫或者說群體遺傳組成及其變化機制在分子水平上的群體遺傳學研究取決于能否得到足夠的DNA多態(tài)性。盡管與一些常用的分子標記(如SSR)相比,二等位基因的SNP顯得多態(tài)性并不高，但如果考慮許多單堿基位點變異所構(gòu)成