深圳大學(xué)理科選修《遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)》課件 重組DNA

重組DNA大腸埃希菌俗名大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道中最主要的細(xì)菌之一是正常菌群的成員出生后數(shù)小時(shí)就進(jìn)入腸道，并伴隨終生能合成維生素B和K，供人體利用能抑制腐敗菌及病原菌（如金黃色葡萄球菌、志賀菌屬）真菌（如白念珠菌）的過(guò)度增殖異位寄居時(shí)可引起腸外感染某些菌株有致病性—消化道感染，導(dǎo)致腹瀉等每個(gè)人每天平均從糞便中排出1011到1013個(gè)可作為糞便污染的檢測(cè)指標(biāo)常作為細(xì)菌的模式生物廣泛用于科學(xué)研究基因工程的工具菌生物學(xué)性狀形態(tài)與染色G-

桿菌，1~3μm（短桿菌）兩端鈍圓、無(wú)芽孢有周鞭毛有普通菌毛/性菌毛能運(yùn)動(dòng)衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢查大腸菌群指37OC24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣包括埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬及腸桿菌屬等大腸菌群指數(shù)指1000ml被檢樣品中的大腸菌群數(shù)生活飲用水的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)coli-index≤3個(gè)我國(guó)2007年開(kāi)始實(shí)施的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每100ml生活飲用水中，不得檢出總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希菌

1、細(xì)菌培養(yǎng)--平板培養(yǎng)劃線法培養(yǎng)涂布法培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI內(nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。Ⅰ型限制性?xún)?nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性?xún)?nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀沃納?阿爾伯1929年生于瑞士。蘇黎士工科大學(xué)畢業(yè)后，在日內(nèi)瓦大學(xué)獲得博士學(xué)位。1971年起，任巴塞爾大學(xué)教授。在研究噬菌體的遺傳現(xiàn)象時(shí)，成功地分離出DNA的限制性酶和甲基化修飾酶，為此獲1978年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。限制—修飾現(xiàn)象Kλ（B）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長(zhǎng)的λ噬菌體第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長(zhǎng)受寄主限制Kλ（K）存活下來(lái)的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制EO輛P:鍛Ef接fi幅ci亦en軌cyof場(chǎng)p椅la鈔ti鞭ng（生宅長(zhǎng)在俊不同香寄主懷中的λ噬菌朵體的成斑支率，表家示限日制程泊度）說(shuō)明K和B菌株熄中存莖在一廚種限劫制系風(fēng)統(tǒng)可呀排除潛外來(lái)量的DN肉A；10-4的存追活率遭是由糧宿主臂限制授系統(tǒng)嶼作用向的結(jié)雁果產(chǎn)生政這種幸現(xiàn)象皂的原阻因何野在甲基僻化酶哭：能使麻細(xì)胞唐自身蔬核酸秋的內(nèi)桐切酶理識(shí)別圍序列番的堿濾基甲骨基化電，從獵而使粒自身詞核酸照免受構(gòu)內(nèi)切鹽酶水辱解——細(xì)菌塊的“努防御興”系唐統(tǒng)核酸羅內(nèi)切均酶：識(shí)別庭并水撞解外哭源DN啄A（外來(lái)革核酸宿在內(nèi)湖切酶他識(shí)別喘序列劑上沒(méi)葵有甲委基化度修飾心作保蘋(píng)護(hù)）研究置發(fā)現(xiàn)瓶：原礙來(lái)是溉由兩態(tài)種酶中配合弱完成浙，一訂種是廉起修冒飾作租用的骨甲基姑化酶寄，另家一種蜘是核猜酸內(nèi)胖切酶限制修飾限制—修飾雷體系Kλ（B）λ（K）λ（B）：沾能夠夠在大敞腸桿雞菌B菌株恒上生妹長(zhǎng)的λ噬菌炸體Kλ（K）再次奴感染K菌株告，則粗形成哭的噬錘菌斑號(hào)很多疫，不課受限興制（K菌株席已經(jīng)灑對(duì)其憲進(jìn)行爸了修舒飾）λ（B）噬錦菌體夾感染瓶大腸度桿菌K菌株卻后，遠(yuǎn)其DN萄A大部劍分被聚內(nèi)切隆酶降堆解了紗，但睛有極究少部叢分能鎮(zhèn)在特逆定序袍列甲逢基化鍛，避粗免被厘酶解繭，因困此有血少量源噬菌妥斑形滑成。在限托制修扶飾系精統(tǒng)中雀，限制吵作用是指潤(rùn)一定雕類(lèi)型執(zhí)的細(xì)鈴菌可兼以通撿過(guò)限霜制性餐酶的敲作用看，破紛壞入蛾侵的掉外源DN盜A（如戶噬菌安體DN字A等）斧，使斬得外陰源DN損A對(duì)生垃物細(xì)放胞的惕入侵星受到宗限制勵(lì)；而宿裙主細(xì)范胞自買(mǎi)身的DN創(chuàng)A分子虜合成遇后，作通過(guò)脊修飾嚇酶的山作用披：在裹堿基醋中特忠定的朗位置銹上發(fā)忘生了傭甲基泊化而副得到賠了修塞飾，爹可免載遭自癥身限游制性走酶的訴破壞賺，這朝就是戴限制先修飾尺系統(tǒng)林中修飾懼作用的含敏義。限制—修飾臘體系名，其功能就是對(duì)保護(hù)虹自身摘的DN瘡A，分腰解外汁來(lái)的DN勒A，以財(cái)保護(hù)刑和維陽(yáng)持自小身遺材傳信悅息的氧穩(wěn)定破，這奏對(duì)細(xì)慌菌的意生存憂和繁墓衍具靠有重超要意鑄義。分類(lèi)核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸酶從核酸鏈的一端開(kāi)始，一個(gè)接一個(gè)地消化降解核苷酸從核酸鏈分子內(nèi)部切割3’，5’磷酸二酯鍵，使之?dāng)嗔研纬尚∑魏怂嵘?nèi)切司酶：按限誓制性爽酶的閱組成殲、限挽制和痛修飾瘋活性戀、切無(wú)斷核架酸的糞情況仁不同樂(lè)，分日三類(lèi)門(mén)（I，II，II術(shù)I），通常永指的擴(kuò)是II型。命名金法H違i袋nd閑II南I同一奪菌株即中所板含的俘多個(gè)脹不同鍬的限屑制性遠(yuǎn)核酸墨內(nèi)切慣酶如從碼流感工嗜血桑桿菌d菌株讓?zhuān)℉a戴em稈op僑hi亦l(xiāng)u例sin宣fl月ue龜nz盞aed）先油后發(fā)圈現(xiàn)3種限梢制性住酶，海則分肌別命甜名為Hi戰(zhàn)ndI，Hi山ndI某I，Hi洽ndI非II大腸桿菌R菌株REscherichia嗜血流感桿菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型號(hào)）種名的頭兩個(gè)字母宿主屬名的第一個(gè)字母coli前3個(gè)字舒母代鐮表來(lái)狹源的畫(huà)生物隨后1個(gè)字居母或婆阿拉化伯?dāng)?shù)圖字代腐表菌竹株最后1個(gè)羅呈馬字孤母代害表發(fā)瓦現(xiàn)或少鑒定雀的次慰序基本址特征識(shí)別垮并切斯割雙宣鏈DN噴A（環(huán)冬狀或動(dòng)線狀遺）分聲子中4-猴8b污p的特農(nóng)定序溪列結(jié)構(gòu)鑄特征弦：旋赤轉(zhuǎn)對(duì)吹稱(chēng)的植回文迫結(jié)構(gòu)切割穩(wěn)后產(chǎn)煤生的基末端死：Co舍he賢si茫ve言t擦er住mi謙nu熄s鳥(niǎo)or突B譜lu站nt朋e倦nd（粘挽性末村端或黃平末驕端）Ec工oRI的識(shí)鵝別序狐列5’始…G獄C失TG漿A棒A室T競(jìng)T主CG批A喚G姜…億3’3’宵…C蠟G線AC乓T亂T敬A屢A漁GC叛T藥C鋪…腎5’Ec袋oRI的切溫割位灣點(diǎn)質(zhì)粒質(zhì)粒流是一引種染色穩(wěn)體外的皂穩(wěn)定與遺傳固因子惹，大脂小從1~虛20和0k烤b不等遮，為醋雙鏈姓、閉合環(huán)的DN腫A分子，并頸以超螺客旋狀態(tài)勒存在暈于宿主掛細(xì)胞中。哲質(zhì)粒味主要月發(fā)現(xiàn)戰(zhàn)于細(xì)菌、放線雜菌和真菌細(xì)胞爐中，慘它具叛有自亡主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力憂，能唯在子姻代細(xì)胞中保證持恒炕定的宵拷貝布數(shù)，遞并表澆達(dá)所嘆攜帶撒的遺傳頸信息。質(zhì)崖粒的銹復(fù)制腥和轉(zhuǎn)劫錄要毯依賴(lài)阻于宿炒主細(xì)寧胞編逗碼的旗某些港酶和蛋白測(cè)質(zhì)，如兩離開(kāi)畏宿主禮細(xì)胞縣則不旬能存獨(dú)活，駕而宿主即使小沒(méi)有海它們臥也可零以正開(kāi)常存神活。寫(xiě)質(zhì)粒屈的存衰在使歲宿主偵具有避一些依額外艘的特距性，崗如對(duì)絕抗生墨素的呈抗性資等。萊德蒼伯格攤（19疲25握~2摔00準(zhǔn)8），大美國(guó)耽遺傳倒學(xué)家豆。細(xì)菌謝遺傳熄學(xué)的鑒創(chuàng)始黑人之圣一。19吧25年5月23日生叼于美薄國(guó)蒙碧特克耐萊市庸。19線44年獲哥倫斯比亞捷大學(xué)學(xué)士洞學(xué)位抹，以唇后曾晚在醫(yī)敞學(xué)院坐學(xué)習(xí)薪，不彼久轉(zhuǎn)伴入耶魯犧大學(xué)，于19累47年獲笛博士界學(xué)位滿。19跟59年起螺任斯坦狂福醫(yī)助學(xué)院教授攻兼遺仁傳學(xué)崖系主槍任。19訴62年任?？夏岢涞戏趾?jiǎn)子醫(yī)毒學(xué)實(shí)撲驗(yàn)室淡主任際。他在萌耶魯海大學(xué)恢期間殺，發(fā)撕現(xiàn)細(xì)菌免的遺妻傳重經(jīng)組。19萄46年，暢他和E.借L.塔特搞姆發(fā)現(xiàn)午遺傳盞重組鄉(xiāng)豐的普份遍性沙。19扛52年發(fā)恨現(xiàn)細(xì)暴菌的F因子。19思52年發(fā)乞現(xiàn)沙寧門(mén)氏蝦菌中尤的普擊遍性炭轉(zhuǎn)導(dǎo)央，19蠢53年發(fā)晃現(xiàn)大腸盟桿菌的溫母和噬相菌體λ在染蛾色體獲上占盈有一鞏定位尖置。19凱56年發(fā)底現(xiàn)λ噬菌爆體能渾進(jìn)行逐局限偷性轉(zhuǎn)股導(dǎo)。維他們認(rèn)的研彈究工做作還鉛包括猶應(yīng)用稀細(xì)菌順的有恥性生踢殖和恩轉(zhuǎn)導(dǎo)去進(jìn)行腰細(xì)菌號(hào)的免牌疫學(xué)算和代貸謝作州用等傭方面憐的研至究。19頃58年他饞和G.跡W.比德蔬爾和E.箏L.塔特平姆共猾同獲斜得諾迅貝爾勢(shì)生理亮學(xué)或南醫(yī)學(xué)項(xiàng)獎(jiǎng)。接合店現(xiàn)象避的發(fā)及現(xiàn)接合哀：指通饑過(guò)細(xì)纖菌細(xì)無(wú)胞的籮直接伯接觸接，遺幣傳物間質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移全到受體并發(fā)都生重慕組的鍛過(guò)程系。19密46年萊德暗伯格和塔幻玉特姆發(fā)現(xiàn)抱了細(xì)菌吼的接協(xié)合。細(xì)菌拍的雜那交實(shí)毒例（19橋46）不同講營(yíng)養(yǎng)單缺陷可型的西大腸販桿菌投（K1脅2）：A菌株萬(wàn)：me牙t-bi依o-th舞r+le怨u+th驗(yàn)i+，B菌株洗：me荒t+bi圍o+th芽r-le渠u-th顫i-這種勤野生柔型細(xì)童胞如襲何出狼現(xiàn)的江？U型管溝實(shí)驗(yàn)猛：A、B菌株份分別升培養(yǎng)磨在基越本培呈養(yǎng)基愉上一邊漏加壓堤和吸襪引使瀉培養(yǎng)藥液充要分混榜合結(jié)果蠶任何雀一臂爭(zhēng)的培辟養(yǎng)基流上均拖未長(zhǎng)慘出野景生型書(shū)細(xì)菌莊。結(jié)論攜：菌咱株A與菌褲株B細(xì)胞乘直接墓接觸貿(mào)（接閑合）頂是野谷生型毫細(xì)胞兵出現(xiàn)弄的必夢(mèng)要條立件；昌兩菌布株直辮接接餓觸后枯導(dǎo)致撇遺傳同物質(zhì)伯轉(zhuǎn)移乒，進(jìn)醫(yī)而發(fā)贈(zèng)生基魔因重票組，社產(chǎn)生乳野生漸型細(xì)列菌。試驗(yàn)金證明堪：接合溫過(guò)程者是一很種單向致轉(zhuǎn)移，A菌株混遺傳煤物質(zhì)B菌株勞，從釘供體蹲到受督體。用大糖腸桿卡菌K1嗽2的菌放株A和菌牲株B，首藝先用些高劑祝量的鏈霉庫(kù)素處理宏菌株A或菌鉆株B，把儉處理妻過(guò)的鴉菌株A跟未棕處理腫過(guò)的予菌株B混合知，或突把處掙理過(guò)掀的菌殃株B跟未累處理畝過(guò)的柳菌株A混合高，發(fā)準(zhǔn)現(xiàn)結(jié)嶼果大途不相余同：⑴們F因子肉：致繞育因飼子或援稱(chēng)性肚因子蠶，是越一種括附加襲體。攜帶F因子贊的菌簡(jiǎn)株稱(chēng)接為供粒體菌孤或雄肚性，植用F＋表示智。未攜茂帶F因子疾的菌問(wèn)株為掃受體勢(shì)菌或永雌性胃，用F－表示和。F因子倦及F＋向F－的轉(zhuǎn)萬(wàn)移⑵結(jié)F因子克的結(jié)哪構(gòu)染色角體外幣遺傳紛物質(zhì)厘（質(zhì)俊粒）栽，環(huán)叢狀DN所A，9×1彩04bp，大倚約為妄大腸救桿菌依環(huán)狀共染色礎(chǔ)體的2%，具廟有40潮~6陡0個(gè)蛋暈白質(zhì)丸基因筑。每個(gè)不細(xì)胞嫩（F＋）有2~加4個(gè)。F因子淡分為洗三個(gè)傍區(qū)域揪：自主勇復(fù)制腿區(qū)：有郵轉(zhuǎn)移括的起查點(diǎn)和2個(gè)復(fù)比制起碗點(diǎn)。雜復(fù)制購(gòu)起點(diǎn)Or趨iT是在鞋染色納體轉(zhuǎn)歷移時(shí)乏進(jìn)行滾環(huán)劈燕復(fù)制時(shí)的浪復(fù)制寸起點(diǎn)桌；Or項(xiàng)iV是在儲(chǔ)營(yíng)養(yǎng)扮時(shí)期殃，即恭游離侵在細(xì)光胞質(zhì)媽中獨(dú)立伴復(fù)制時(shí)的姜復(fù)制率起點(diǎn)喬。轉(zhuǎn)移崇區(qū)：主陡要有唱合成性傘蠶毛即F纖毛（Fpi盯li）的檔操縱榨子。F纖毛革是由判性傘毛械蛋白危構(gòu)成悄，呈很管狀罷，又誼叫接魔合管童。通創(chuàng)過(guò)接境合管別可將堤供體經(jīng)和受削體細(xì)炒胞相糟聯(lián)。乎共30峰kb長(zhǎng)，就有40個(gè)基楊因與DN顧A的轉(zhuǎn)毛移有椒關(guān)。重組嚴(yán)區(qū)：有4個(gè)插急入順兄序（IS），乘通過(guò)脖和宿脅主染志色體上的IS同源雁重組滅或通曾過(guò)轉(zhuǎn)葵座，F(xiàn)因子虎可以室整合劍到宿路主不守同位濫點(diǎn)上臣。⑶種F因子或的三場(chǎng)種狀令態(tài)②有一窗個(gè)自陳主狀緞態(tài)的F因子裹，即F＋細(xì)胞睡；③帶有烏一個(gè)悶整合自的F因子藝的細(xì)毛胞叫高頻蔑重組凱細(xì)胞，Hf絨r細(xì)胞破。①?zèng)]有F因子奇，即F－細(xì)胞毀；F＋與F－菌（1）有F因子連的細(xì)昂菌稱(chēng)戰(zhàn)為F＋，細(xì)惡菌增筐殖時(shí)宣可把F因子子傳遞趕給后撓代細(xì)駝胞（禮通過(guò)死自主青復(fù)制顛）。（2）沒(méi)仁有F因子煉的細(xì)對(duì)菌稱(chēng)遭為F－，F(xiàn)＋細(xì)菌辟經(jīng)吖模啶橙處稅理而下丟失搬，成租為F－。F因子爛一經(jīng)叨丟失榆，細(xì)胞攀中便飛不再執(zhí)出現(xiàn)販；（3）F＋可以非和F－雜交鞭，而裝不能娘和F＋雜交壩；（4）F＋菌與F－菌混喚合（膜即F＋×F－）1小時(shí)希后，敬約95奪%的F－菌轉(zhuǎn)息變?yōu)镕＋菌，頭而原窮來(lái)的F＋仍然憲保留裁有F因子垮。(1剃)堆F纖毛時(shí)合成輝：由性傘肯毛蛋硬白構(gòu)成派，接合提管使供值體和蹤蝶受體垃細(xì)胞拳接觸肺。(2過(guò))轉(zhuǎn)移總啟動(dòng)負(fù)：F因子驗(yàn)從轉(zhuǎn)煩移復(fù)修制起征點(diǎn)(Or專(zhuān)iT)開(kāi)始沙向F－轉(zhuǎn)移優(yōu)（5’端首舟先進(jìn)吸入受傭體）。(3租)單鏈萬(wàn)轉(zhuǎn)移否，滾胸環(huán)復(fù)砍制。F纖毛旱與接砍合管F＋×F－Hf此r是F因子霸整合世到E.繁co烈li染色隔體上拾的結(jié)投果E.執(zhí)co童li染色宗體上堡有20個(gè)以盾上的助整合叛位點(diǎn)為；整合懼通過(guò)IS等同夸源重甩組或勁轉(zhuǎn)座績(jī)實(shí)現(xiàn)滑；F因子脊有多唱個(gè)整挖合位救點(diǎn)，滋主要甚在IS郊3處。分子拌克隆pU沖C1革8pU集C1帳9含四訂個(gè)部微分：（1）來(lái)澆自pB屈R3扎22的質(zhì)靜粒復(fù)杠制起主點(diǎn)（or厘i）；（2）am跳pr;（3）大蜜腸桿率菌β半乳枯糖苷熄酶基考因（la竭cZ’）的新啟動(dòng)雀子及章其編沙碼α-肽鏈笛的DN澇A序列定；（4）多運(yùn)克隆暈位點(diǎn)遲（MC挖S）la運(yùn)cZ`Or供iAm駕prMC技S藍(lán)白寨斑篩儀選重寺組子攻的原鐘理：la胳cZ’編碼β半乳授糖苷境酶的α肽，鳳在異勤丙基擦硫代-凱β-貼D-半乳元糖苷聞（IP恐TG）的那誘導(dǎo)熟下，拔使呈希色底草物5-溴-4騎-氯-3辰-吲哚-幫β-窮D-半乳招糖苷掘（X-盞ga元l）被挨分解另產(chǎn)生剝藍(lán)色選。因熔此攜慶帶空文載體軍的大主腸桿售菌呈恩藍(lán)色蒼菌落灣。外源倦基因妥的插濕入使α肽失北活，林因而慢攜帶臨外源陳基因用的重哄組子此菌落域呈白線色。利用迷菌落形顏色淺篩選景重組詢(xún)子PU限C質(zhì)粒診