植物細(xì)胞工程基本原理

關(guān)于植物細(xì)胞工程基本原理第1頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三2.1植物細(xì)胞全能性(totipotent)在離體培養(yǎng)下，植物的體細(xì)胞或性細(xì)胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生器官分化和再生，成為具有與母體植株相同遺傳信息的植株的能力。植物細(xì)胞全能性的相對性不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng)；動、植物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯差異。細(xì)胞全能性并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物個體。第2頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三2.2植物細(xì)胞分化基因的差異性表達(dá)，即為細(xì)胞分化；具體表現(xiàn)為內(nèi)部生理變化和外部形態(tài)變化。細(xì)胞分化使細(xì)胞功能趨于專門化，更有利于提高生理功能的效率。因此,分化是進(jìn)化的表現(xiàn),越高級的植物類群,分化水平越高,細(xì)胞分工越細(xì),機(jī)體代謝水平也越高。第3頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三2.3離體條件下植物細(xì)胞的脫分化和再分化細(xì)胞脫分化和再分化的概念細(xì)胞全能性與脫分化和再分化的關(guān)系第4頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞脫分化（dedifferentiation)是指失去已分化細(xì)胞的典型特征，或消除了細(xì)胞分工，使之回復(fù)到分生組織狀態(tài)，或胚性細(xì)胞狀態(tài)。Flash細(xì)胞脫分化階段 啟動階段，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)增生，并開始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)； 演變階段，此時細(xì)胞核開始向中央移動，質(zhì)體演變成原質(zhì)體； 脫分化終結(jié)期，細(xì)胞回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開始。一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處的位置和生理狀態(tài)。第5頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三第6頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三愈傷組織(callus)：脫分化后的細(xì)胞，往往經(jīng)過細(xì)胞分裂形成一團(tuán)無特定結(jié)構(gòu)和功能的松散的薄壁細(xì)胞團(tuán)。草莓煙草第8頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞再分化（redifferentiation)：脫分化后的分生細(xì)胞（愈傷組織）在特定的條件下，重新恢復(fù)細(xì)胞分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進(jìn)一步發(fā)育成完整植物體的過程。極性：是指植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。

在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。第9頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞全能性脫分化再分化個體再生細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。細(xì)胞分裂細(xì)胞全能性與脫分化和再分化的關(guān)系第10頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三器官發(fā)生植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。通過器官發(fā)生形成再生植株有三種方式：第11頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三先芽后根第12頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三先根后芽第13頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。第14頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三植株再生兩種途徑：器官發(fā)生途徑:根芽器官直接分化形成植株體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑:產(chǎn)生具有胚芽、胚根的胚狀體結(jié)構(gòu)再形成植株第15頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生胚狀體：（embryoid）亦稱體細(xì)胞胚或體胚。在體外，由體細(xì)胞（非合子細(xì)胞）經(jīng)胚胎發(fā)育產(chǎn)生的類似胚胎的結(jié)構(gòu)。其發(fā)育過程與合子胚類似，經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚及子葉胚等幾個階段。在其發(fā)生的最早階段就具有兩極性，即根端（胚根）和莖端（胚芽），并且與母體細(xì)胞或外植體的維管束無直接聯(lián)系胚狀體一開始就是一個完整植物的雛形，可通過根端或類似胚柄結(jié)構(gòu)從外植體或愈傷組織中取得營養(yǎng)。很容易從愈傷組織的表面脫離下來，在適宜條件下長成一株植物。第16頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三魔芋體細(xì)胞胚魔芋第17頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三如何鑒別胚狀體？（I）與器官發(fā)生形成個體的途徑相比：

胚狀體具雙極性（doublepolarity）生理隔離（physiologicalisolation）遺傳性相對穩(wěn)定 由于大多數(shù)體細(xì)胞胚起源于單細(xì)胞，因此對于單個植株來講，通過體細(xì)胞胚形成的再生植株，其遺傳特性相對穩(wěn)定。重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特性。第18頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三如何鑒別胚狀體？（II）與合子胚相比：合子胚在發(fā)育初期具有明顯胚柄，體細(xì)胞胚沒有真正的胚柄合子胚的子葉是相當(dāng)規(guī)范的，要以作為分類的依據(jù)，而體細(xì)胞胚的子葉常不規(guī)范，有時具有兩片以上的子葉與相同植物相比，體細(xì)胞胚體積明顯小于合子胚體細(xì)胞胚沒有休眠，而合子胚胚胎發(fā)育完全進(jìn)入子葉期以后，經(jīng)過一系列的物質(zhì)積累和脫水就進(jìn)入休眠。第19頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三類似于動物胚胎早期的發(fā)育胚胎細(xì)胞發(fā)生發(fā)育早期2次均等分裂胚結(jié)構(gòu)形成第20頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接地發(fā)生，大致分為五種：直接從器官外植體上發(fā)生(以葉片為例）愈傷組織發(fā)生懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生單倍體細(xì)胞發(fā)生原生質(zhì)體發(fā)生第21頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑1：葉片

誘導(dǎo)階段胚胎發(fā)育階段(蘭草,Chen等,1999)蘭草第22頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑2：愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球形胚形成子葉胚期蝴蝶蘭,Lin等,2000第23頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三蝴蝶蘭第24頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑3：（懸浮細(xì)胞）發(fā)生過程：胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到適宜的胚胎發(fā)生培養(yǎng)基上以后，其外圍的許多細(xì)胞開始不均等分裂，靠近細(xì)胞團(tuán)方向的一個細(xì)胞較大，以后發(fā)育成類似胚柄的結(jié)構(gòu)。另一個細(xì)胞則繼續(xù)分裂形成類似原胚的結(jié)構(gòu)，以后經(jīng)過類似于體內(nèi)的發(fā)育過程，經(jīng)球形期、心形期等發(fā)育階段形成完整的體細(xì)胞胚。懸浮液中有兩類細(xì)胞：

不具備胚胎發(fā)生潛力（自由分散、大、高度液泡化）

具備成胚能力的胚性細(xì)胞團(tuán)（成簇成團(tuán)、小、胞質(zhì)致密）第25頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三懸浮細(xì)胞體細(xì)胞胚發(fā)生過程愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)球形胚形成成熟子葉胚第26頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素1.生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

(1)生長素類:

(例）在離體條件下胡蘿卜體細(xì)胞胚的發(fā)育是一個包括兩個步驟的過程,每個步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長素的培養(yǎng)基，通常所用的生長素是2,4-D,濃度范圍0.5～1mg/L。在這樣一種培養(yǎng)上,愈傷組織的若干部位分化形成分生細(xì)胞團(tuán),稱作“胚性細(xì)胞團(tuán)”。在增殖培養(yǎng)基上反復(fù)繼代,胚性細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量不斷增加,但并不出現(xiàn)成熟的胚。然而,如果把胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到一種生長素含量很低或完全沒有生長素的培養(yǎng)上,它們就能發(fā)育為成熟的胚。

第27頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三(2)細(xì)胞分裂素類:

既或促進(jìn)也可抑制體細(xì)胞胚的發(fā)生,這主要取決于植物的種類及其基因型。一般而言,細(xì)胞分裂素對于促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟有顯著作用,特別有利于子葉的發(fā)育。另外有研究表明,不同的外植體對于細(xì)胞分裂素的需要可能具有不同的專一性,如在胡蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn),雖然激動素對胚胎發(fā)生過程表現(xiàn)抑制作用,但濃度為0.1μM的玉米素卻能促進(jìn)這個過程,而6-BA對胡蘿卜則是促進(jìn)其愈傷組織的增殖,但不形成胚性愈傷組織。第28頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三(3)赤霉素類:

赤霉素類能抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生,但對于許多植物而言,赤霉素對于體細(xì)胞胚的成熟與萌發(fā)有促進(jìn)作用。(4)脫落酸:

抑制劑特別是ABA,在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的作用正逐漸被提示出來,ABA是一種天然產(chǎn)生的生長調(diào)節(jié)劑,當(dāng)把無抑制作用劑量(通常是0.1～1μM)的ABA用于荷蘭芹屬培養(yǎng)物時,可以允許胚成熟過程進(jìn)行。但是其抑制不定胚的啟動。小麥、石刁柏、顛茄則要在適當(dāng)濃度的生長素和較高濃度的激動素時才能分化出胚狀體第29頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三石刁柏顛茄第30頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三2.氮源氮源有還原態(tài)氮(NH4+)和氧化態(tài)氮(NO3-)兩種在以KNO3為唯一氮源(如White培養(yǎng)基)的培養(yǎng)上建立起來的愈傷組織,去掉生長素以后不能形成胚。

德國Reinert等在栽培胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中(培養(yǎng)基均為White培養(yǎng)基)得到以下結(jié)果:[NH4+](mM)[NO3-](mM)體胚發(fā)生數(shù)(個/2ml)10401131±21905519±0.309511.3±4.1第31頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三3.低溫預(yù)處理低溫(3℃）對四季橘花粉胚形成的影響處理時間（天）培養(yǎng)花粉花胚狀體（枚）(個)(％)084880.945723121.6610902151.661584650.592047020.432543430.69第32頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三4.植物的遺傳性一個離體培養(yǎng)的煙草花藥，可以產(chǎn)生200個體細(xì)胞胚?；ㄋ幣囵B(yǎng)中胚狀體誘導(dǎo)率比較誘導(dǎo)率（％）煙草>30柑桔0.43%~1.66%白菜1.1%~1.68%第33頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三蘋果品種間花藥培養(yǎng)胚狀體發(fā)生頻率比較品種發(fā)生頻率（％）元帥1.9%~2.5%國光0.0%~1.2%金冠0.2%~3.4%赤陽0.3%~1.5%第34頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三生理狀態(tài)對體細(xì)胞胚形成的影響第35頁，講稿共39頁，2023年5月2日，星期三生理狀態(tài)對體細(xì)胞胚形成的影響如毛果楊花藥誘導(dǎo)在不同年份效果截然不同以葉片為誘導(dǎo)材料的:黑楊x遼楊以組培苗的針刺葉片為材料，才能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織NC-5339取組培苗未展開的葉片。緣毛楊需先進(jìn)行BA長時期暗培養(yǎng)。因此，對外植體材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇或前處理，有利于體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。－－:于志水，男，1977年10月生，北京林業(yè)大學(xué)林木花卉遺傳育種教育部重點開放實驗室，碩士研究生。楊樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究概況,東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報2005.1第36頁，講稿共39頁，20