BDNF及受體TrkB在大鼠小腦的表達(dá)研究

BDNF及受體TrkB在大鼠小腦的表達(dá)研究

【摘要】目的：研究BDNF及其受體TrkB在大鼠小腦時空分布變化。方法：進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗，觀察BDNF及TrkB在正常大鼠發(fā)育期、成年期和老齡期小腦內(nèi)的定位分布及時間變化。結(jié)果：發(fā)育期小腦皮質(zhì)的外顆粒層、梨狀細(xì)胞層和內(nèi)顆粒層均有BDNF表達(dá)，梨狀細(xì)胞層的陽性Purkinje細(xì)胞染色明顯。成年期內(nèi)顆粒層陽性細(xì)胞逐漸增多，梨狀細(xì)胞層的Purkinje細(xì)胞BDNF表達(dá)及陽性細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰。老年期陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度呈增齡減低，Purkinje細(xì)胞發(fā)生了輕度的退行性變，TrkB表達(dá)在小腦皮質(zhì)分布模式類似BDNF的表達(dá)。結(jié)論：BDNF及TrkB表達(dá)的時空變化始終與小腦皮質(zhì)的發(fā)生發(fā)育過程相關(guān)。生后0天，二者在小腦皮質(zhì)外顆粒層、梨狀細(xì)胞層和內(nèi)顆粒層均有較強(qiáng)表達(dá)，以梨狀細(xì)胞層為主。第10天左右，小腦皮質(zhì)發(fā)育為典型的三層結(jié)構(gòu)，Purkinje細(xì)胞表達(dá)BDNF及TrkB最為顯著。成年后，表達(dá)水平保持較穩(wěn)定。老齡后明顯減弱，BDNF及TrkB陽性Purkinje細(xì)胞發(fā)生輕度的退行性改變。

【關(guān)鍵詞】BDNF；TrkB；免疫組織化學(xué)染色；大鼠；小腦；表達(dá)

StudytheExpressionofNeuiotrophinFactorandTyrosineKinaseReceptorinRatCerebellum

Abstract:ObjectiveStudysystematicallythedistributeofBDNFandTrkBinthenormalratObservesystematicallytheexpressionchangsofBDNFandTrkBinthenormalratbrainsduringdevolopementphaseandadulthoodandagedphaseandthireBDNFandTrkBwereexpressedincerebellumduringdevolopementphaseTheexternalgranulelayerbecamemolecularlayeralongwiththemigrationofgranulecellstotheinternalgranulecelllayer,andtheimmuostainingcellsincreasedgradullyduringadulthood.phaseThePurkinjeimmuoreactivecellsappeartopeak.BDNFandTrkBwereexpressedsignificantlyinPurkinjecellsduringadulthood.Duringagedphase,PurkinjecellsslightlyTheexpressionofBDNFandTrkBreachedapeakincerebellumofratsonPND20.TheexpressionofBDNFandTrkBdecreasedgraduallyafteradulthood.Duringagedphase,theexpressionofBDNFandTrkBincreasedsignificantly,andtheformofthecellcelloccureddegeneration.

Keywords:BDNF；TrkB；SABC;Rats；Cerebellum；Expression

神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF),是一類對中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有營養(yǎng)作用的活性蛋白,這些小分子蛋白質(zhì)具有55%～65%相同的氨基酸順序,統(tǒng)稱為神經(jīng)生長因子家族,包括神經(jīng)生長因子(NGF),腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3),神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5(NT4/5)，神經(jīng)營養(yǎng)因子6(NT6)和神經(jīng)營養(yǎng)因子7(NT7)［1～4］。NTFs受體有兩種不同的家族，一種受體是低親和力的神經(jīng)生長因子受體，P75是腫瘤壞死因子家族成員之一，可以無選擇地和所有的神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合，發(fā)揮生物效應(yīng)。另一種受體是高親和力酪氨酸激酶家族(Trks)受體TrkA、TrkB、TrkC。TrkA是NGF的受體,TrkC是NT3的受體,TrkB的最適配體為BDNF,也是NT4/5的最適配體和NT3的第二配體［5～7］。BDNF及TrkB對神經(jīng)元的生存、生長、分化有重要的影響。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，BDNF可誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞的定向分化，促使神經(jīng)元增生，加快神經(jīng)元遷移，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的成熟和完善。在成體，BDNF則表現(xiàn)出廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)活性，可以促進(jìn)神經(jīng)元對葡萄糖等能量物質(zhì)的利用，提高細(xì)胞酶的活性。對神經(jīng)元的存活及正常生理功能的維持有著積極的意義。BDNF及TrkB廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。近年,大量的工作主要集中于研究BDNF及TrkB的生理作用及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷中的變化,也有一些有關(guān)腦發(fā)育過程中BDNFmRNA表達(dá)變化的報道。但未見有系統(tǒng)地觀察機(jī)體正常發(fā)育過程中BDNF及TrkB在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中時空分布的研究報道。為此，本研究擬應(yīng)用免疫組織化學(xué)ABC法，觀察BDNF及TrkB在正常大鼠發(fā)育期、成年期、老齡期小腦內(nèi)的定位分布及時間變化規(guī)律。以期為探討B(tài)DNF及TrkB在神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育過程中的作用提供較系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)資料。

1材料與方法

儀器與試劑AO光學(xué)顯微鏡、CS202型電熱保溫干燥箱、CS213型電熱培養(yǎng)箱、Series1000振動切片機(jī)。兔抗大鼠BDNF抗體、兔抗大鼠TrkB抗體、大鼠SABC試劑盒、3，32氨基聯(lián)苯胺，試劑均為Sigms公司產(chǎn)品。

實驗動物及分組實驗用SD大鼠。種鼠均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。雄鼠10只，體重為200g～220g；雌鼠40只，體重280g～300g，按雄、雌鼠1：4于每日晚10:00~11:00合籠，次日晨7:00~8:00檢查雌鼠陰道分泌物。用醮水棉簽探入雌鼠陰道，順時針或逆時針旋轉(zhuǎn)2圈~3圈后取出，涂于干凈載玻片，鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)絮狀精子，即確認(rèn)為懷孕。孕鼠分籠單養(yǎng)，標(biāo)記受孕時間，至孕21天生產(chǎn)。取同窩幼鼠2只~3只，12只構(gòu)成一組，并記錄出生時間。以出生后0天即第1個24h為P0組,依此類推分為：發(fā)育期、成年期、老年期共16組,每組12只。

免疫組化學(xué)實驗

組織制備動物經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后，打開胸腔，經(jīng)心尖插入鈍注射針頭至主動脈根部，剪開右心房；快速灌注溫生理鹽水約200ml；注入冷的4%多聚甲醛400ml，先快后慢，持續(xù)1h；斷頭取腦，置相同固定液后固定過夜；次日，組織行振蕩切片，片厚40μm；小腦皮質(zhì)的切片6套，分別用BDNF、TrkB免疫組化染色。

SABC法免疫組織化學(xué)染色切片經(jīng)PBS清洗3次，10min/次；%H2O2中30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗3次，10min/次；1%Triton中30min，PBS清洗3次，10min/次；正常兔血清封閉液30min；入一抗，于4℃冰箱內(nèi)孵育72h，期間每天搖動3次，并注意密封，然后再經(jīng)PBS洗3次，10min/次；生物素化二抗，37℃孵育1h，PBS洗3次，10min/次；SABC復(fù)合物，37℃孵育30min，PBS洗2次，10min/次，TBS洗1次，10min；DAB顯色，注意避光，放入切片顯色1min～5min，鏡下觀察染色，盡可能使背景染色一致；PBS洗3次，10min/次，蒸餾水洗3次，5min/次；裱片陰干，常規(guī)脫水，透明，樹膠封片。

結(jié)果及數(shù)據(jù)處理光鏡下觀測小腦皮質(zhì)半球后外側(cè)部，每部位取5個視野，計數(shù)BDNF、TrkB陽性神經(jīng)元的數(shù)目。所獲數(shù)據(jù)行方差分析統(tǒng)計學(xué)處理，并定義為差異有顯著性界值，為高度差異有顯著性界值。數(shù)據(jù)處理過程由SPSSforWindows軟件完成。

2結(jié)果

BDNF染色生后0d，小腦皮質(zhì)的外顆粒層、梨狀細(xì)胞層和內(nèi)顆粒層均有BDNF表達(dá)，染色明顯。梨狀細(xì)胞層的陽性Purkinje細(xì)胞胞體較大，輪廓依稀可見，呈不規(guī)則的單層排列，胞漿染色較深，胞核不著色。內(nèi)顆粒層有較多而散在分布的BDNF陽性神經(jīng)元，染色較陽性Purkinje細(xì)胞淡，輪廓不清。外顆粒層也可見少量的陽性細(xì)胞。出生后5d、10d和15d，隨著外顆粒層細(xì)胞穿過梨狀細(xì)胞層向內(nèi)遷移至內(nèi)顆粒層，三層內(nèi)的陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度逐漸加深，以Purkinje細(xì)胞BDNF表達(dá)增加為主，但未見陽性突起。同時內(nèi)顆粒層深部的小腦白質(zhì)出現(xiàn)了染色較強(qiáng)的陽性纖維，并深入內(nèi)顆粒層。生后20d、25d，隨著小腦皮質(zhì)三層結(jié)構(gòu)發(fā)育的逐漸成熟，外顆粒層逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿訉?，隨之陽性細(xì)胞逐漸減少，染色變淡。內(nèi)顆粒層陽性細(xì)胞逐漸增多胞體較小，染色較深。梨狀細(xì)胞層的Purkinje細(xì)胞BDNF表達(dá)及陽性細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰，,差異有顯著性，細(xì)胞呈規(guī)則的單層排列，胞漿染色明顯加深，細(xì)胞輪廓清晰，突起仍不明顯，胞核依舊空染。白質(zhì)中的陽性纖維染色較P15組弱，纖維增粗，亦可見走入內(nèi)顆粒層。從25d起，生長、發(fā)育到老年的早期，陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物的模式未變，陽性細(xì)胞主要為梨狀細(xì)胞層的Purkinje細(xì)胞，在分子層和內(nèi)顆粒層有散在分布的陽性細(xì)胞，所有陽性細(xì)胞形態(tài)、染色強(qiáng)度與P20組基本一致。內(nèi)顆粒層纖維的BDNF表達(dá)量較分子層高。老年期從P540組、P720組到P900組，陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度呈增齡減低，，差異無顯著性，陽性Purkinje細(xì)胞發(fā)生了輕度的退行性變，表現(xiàn)為染色變淡，數(shù)量有所減少，胞體輪廓皺縮，外觀僵直，胞核形態(tài)不規(guī)則。分子層和顆粒層仍有極淡染的少量陽性細(xì)胞。本實驗于小腦皮質(zhì)發(fā)育的不同階段，對BDNF表達(dá)的主要神經(jīng)元陽性Purkinje細(xì)胞進(jìn)行了計數(shù)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)的高峰出現(xiàn)在PND20到PND25，見圖1、圖3。

圖1小腦皮質(zhì)BDNF及TrkB陽性細(xì)胞數(shù)略

TrkB染色生后0d，小腦皮質(zhì)的外顆粒層、梨狀細(xì)胞層和內(nèi)顆粒層均有TrkB表達(dá)，染色較弱。梨狀細(xì)胞層的TrkB陽性Purkinje細(xì)胞胞體較大，輪廓依稀可見，呈不規(guī)則的單層排列，胞漿染色較深，胞核不著色。內(nèi)、外顆粒層未見TrkB陽性神經(jīng)元。生后5d、10d和15d，隨著外顆粒層細(xì)胞穿過梨狀細(xì)胞層向內(nèi)遷移至內(nèi)顆粒層，內(nèi)、外顆粒層也出現(xiàn)陽性細(xì)胞，染色較Purkinje陽性細(xì)胞弱，所有陽性細(xì)胞輪廓不清，未見陽性突起。生后20d、25d，小腦皮質(zhì)的三層結(jié)構(gòu)清晰，TrkB免疫反應(yīng)染色逐漸加深，陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)最高峰。顆粒層出現(xiàn)散在陽性細(xì)胞，胞體較大，染色較深。梨狀細(xì)胞層的Purkinje細(xì)胞呈規(guī)則的單層排列，胞漿染色明顯加深，細(xì)胞輪廓清晰，突起仍不明顯，胞核小而空染。從25d起，生長、發(fā)育到成年180d，陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物的模式未變，陽性細(xì)胞主要為梨狀細(xì)胞層的Purkinje細(xì)胞，在分子層和內(nèi)顆粒層有散在分布淡染的陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)量有所減少，染色較淡。在PND25，所有陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度達(dá)高峰，,差異有顯著性，大多數(shù)陽性Purkinje細(xì)胞的胞核呈不均勻染色陽性。老年的早期到P900組，陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度呈增齡減低，分子層和顆粒層陽性細(xì)胞明顯減少，僅有極少數(shù)陽性細(xì)胞散在分布。與成年期比較，陽性Purkinje細(xì)胞數(shù)量變化不大，，差異無顯著性，但形態(tài)發(fā)生了輕度的退行性變，染色變淡，胞體輪廓僵直，胞核形態(tài)不規(guī)則，見圖2。

圖2不同季度陽性細(xì)胞數(shù)直方圖略

圖3小腦皮質(zhì)BDNF、TrkB免疫組化染色略

3討論

BDNF對神經(jīng)元的生存、生長、分化和可塑性有重要影響。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，BDNF通過TrkB受體的介導(dǎo)可誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞的定向分化，加快神經(jīng)元遷移，促使神經(jīng)元增生，確保神經(jīng)系統(tǒng)的成熟和完善。在成體，則表現(xiàn)出廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，對神經(jīng)元的存活、正常生理功能的維持及損傷后的修復(fù)有著積極的意義。神經(jīng)營養(yǎng)因子假說理論［8］認(rèn)為，處于發(fā)育中的神經(jīng)元，其存活依賴于它所支配的靶細(xì)胞產(chǎn)生的特殊的營養(yǎng)因子。在發(fā)育早期，各類神經(jīng)元的數(shù)目過量，那些生長到錯誤靶組織或在靶組織錯誤定位的多余神經(jīng)元因得不到足夠的營養(yǎng)因子而退化［9］。BDNF基因敲除大鼠大部分在生后兩天即死亡，少數(shù)可存活2周~3周［8］。我們的實驗結(jié)果從正面支持了神經(jīng)營養(yǎng)因子假說理論，也符合大鼠個體生長發(fā)育在生后2周~3周處于高峰，4周以后全身器官發(fā)育已基本完成這一事實。國內(nèi)外關(guān)于BDNF在小腦皮質(zhì)表達(dá)的研究甚少，僅有的幾篇報道也不系統(tǒng)。本研究首次系統(tǒng)觀察了大鼠小腦皮質(zhì)BDNF及受體TrkB終生的時空表達(dá)。結(jié)果顯示BDNF及受體TrkB表達(dá)的時空變化始終與小腦皮質(zhì)的發(fā)生發(fā)育過程相關(guān)。在PND0時，小腦皮質(zhì)發(fā)育尚未成熟，呈現(xiàn)外顆粒層、梨狀細(xì)胞層和內(nèi)顆粒層這樣的原始分層狀態(tài)，此時即有BDNF及受體TrkB在三層中的較強(qiáng)表達(dá)，尤其梨狀細(xì)胞層的Purkinje細(xì)胞表達(dá)相對較強(qiáng)。隨著皮質(zhì)發(fā)育的逐漸成熟，外顆粒層由于細(xì)胞不斷內(nèi)遷至內(nèi)顆粒層以及深層細(xì)胞突起的外伸而逐漸發(fā)育成分子層，梨狀細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層逐漸發(fā)育成熟，至PND10時已發(fā)育為典型的小腦皮質(zhì)三層結(jié)構(gòu)。在此期間BDNF及受體TrkB的表達(dá)也隨之發(fā)生相應(yīng)的改變，外顆粒層BDNF及受體TrkB陽性細(xì)胞的數(shù)目和表達(dá)強(qiáng)度均逐漸下降，而其它兩層陽性細(xì)胞的數(shù)目和表達(dá)強(qiáng)度均不斷升高，以梨狀細(xì)胞層的陽性Purkinje細(xì)胞表達(dá)最為顯著。在PND20和PND25時，Purkinje細(xì)胞BDNF及TrkB的表達(dá)達(dá)高峰，成年后，二者的表達(dá)水平輕度下降后進(jìn)入一個較穩(wěn)定的平臺期。從PND360開始，小腦皮質(zhì)步入老齡期改變，BDNF及TrkB的表達(dá)也出現(xiàn)明顯的減弱，陽性Purkinje細(xì)胞發(fā)生了輕度的退行性變，染色變淡，數(shù)量減少，胞體輪廓皺縮，外觀僵直，胞核形態(tài)不規(guī)。上述BDNF及TrkB表達(dá)的變化規(guī)律較客觀地體現(xiàn)了二者參與小腦皮質(zhì)生后從發(fā)育、成熟到衰老的過程。梨狀細(xì)胞層Purkinje細(xì)胞是小腦皮質(zhì)惟一的傳出神經(jīng)元，其內(nèi)BDNF及TrkB呈持續(xù)性高表達(dá)，與二者在大腦皮質(zhì)的表達(dá)相呼應(yīng)，即小腦新皮質(zhì)的進(jìn)化程度與大腦新皮質(zhì)發(fā)生發(fā)育相一致，充分表明BDNF及TrkB在錐體外系和錐體系的軀體運(yùn)動調(diào)節(jié)中占有重要地位。

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