溶血空斑實驗

關(guān)于溶血空斑實驗第1頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三實驗目的掌握溶血空斑試驗檢測原理掌握溶血空斑的操作方法第2頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三實驗原理●溶血空斑實驗（plaqueformingcellassay,PFC）體外檢測單個抗體形成細胞（B淋巴細胞）的一種方法?！衿湓硎菍⒕d羊紅細胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴結(jié)或小鼠脾細胞制成細胞懸液，與一定量的SRBC結(jié)合，在37℃條件下免疫活性淋巴細胞釋放出溶血素，在補體的參與下，可溶解周圍的綿羊紅細胞，從而在每個抗體形成細胞周圍形成一個可見的溶血空斑。第3頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三●一個空斑代表一個抗體形成細胞（即B細胞），空斑的數(shù)量反映機體的體液免疫功能?！窨瞻叽笮”硎究贵w生成細胞產(chǎn)生抗體的多少。由于溶血空斑試驗具有特異性高，篩選力強，可直接觀察等優(yōu)點，故可用做判定免疫功能的指標，觀察免疫應答的動力學變化，并可進行抗體種類及亞類的研究。

第4頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三第5頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三實驗材料與試劑器材：平皿、37℃水浴箱、離心機、顯微鏡試劑：①SRBC懸液：取無菌脫纖維羊血，用NS或PBS離心洗滌3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）懸成細胞濃度為2.00×109個/mL第6頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三②Hanks液（含Ca2+、Mg2+

）③底層基（1.4%）和表層基（0.7%）：將瓊脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%兩種濃度。將表層基分裝于小試管中，每管2ml④補體：新鮮豚鼠血清⑤小牛血清：56℃滅活30min第7頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三實驗步驟㈠免疫脾細胞懸液的制備①小鼠免疫：每只小鼠經(jīng)尾靜脈注入上述SRBC懸液2.00×104個/0.2ml或者腹腔注射4.00×108

個/1ml。②單個脾細胞懸液的制備：將免疫后第四天的小鼠拉頸處死，解剖取出脾臟，放入PH7.2的PBS中漂洗，去掉結(jié)締組織，加入適量的PBS，用鑷子擠壓脾臟，稍靜置，吸上清液至離心管中，2500r/min離心5min，棄上清后，定量加入PBS液1ml，混勻，再用PBS液稀釋10倍（濃度約為5×106個/ml）第8頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三（二）傾注底層瓊脂將1.4%瓊脂凝膠加熱融化后，傾注于水平位置的平皿內(nèi)，每皿6ml，凝固后，用前置55℃水浴鍋中預溫。第9頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三（三）表層瓊脂的制備將0.7%的瓊脂融化后，置于55℃恒溫水浴箱中，依次加入以下試劑：⑴20%SRBC懸液0.1ml。⑵小牛血清0.1ml。⑶5.00×106/ml脾細胞懸液0.1ml。迅速混勻后，傾注于已鋪好底層瓊脂的平皿內(nèi)，使之均勻鋪平凝固后，靜置約15min，放37℃溫育2h。第10頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三（四）加補體從溫箱中取出平皿，每皿加入1:5稀釋的新鮮豚鼠血清1ml，繼續(xù)放37℃溫箱中溫育30min后取出，觀察溶血空斑。也可在室溫下放置1h，4℃冰箱過夜，次日觀察結(jié)果。第11頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三結(jié)果判定

觀察時，將平皿對著光亮處，用肉眼或放大鏡觀察每個溶血空斑的溶血狀況，并記錄整個平皿中的空斑數(shù)，同時求出每百萬個脾細胞內(nèi)含空斑形成細胞的平均數(shù)。

第12頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三注意事項⒈

對SRBC的要求：因為SRBC既是免疫原，也是靶細胞和指示細胞，故要求SRBC應新鮮，洗滌不超過3次，每次2

000r/min離心5min，細胞變形或脆性增大者均不能使用。2．免疫所用SRBC的數(shù)量：尾靜脈注射以2.00×104

個/0.2ml為宜。腹腔注射為4.00×108

個

/ml，用量小，如低于1.00×107個/ml注射0.5ml，空斑形成極少；用量過大，超過2.50×109個/ml，不能形成空斑。第13頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三3．采取免疫脾的時間：無論是經(jīng)尾靜脈還是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾為宜，過早或過晚空斑都形成極少。4．脾細胞的活力：

為了保證脾細胞的活力，制備脾細胞過程中所用PBS（或Hank’s液），最好臨用時方從4℃冰箱中取出，或整個操作過程應在冰浴中進行。5．傾注平板的要求：底層要平，表層要把握好溫度。不要有氣泡，表層基要求混合均勻。第14頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三6．補體的活力：補體活力的大小，對溶血空斑的形成關(guān)系很大。如出現(xiàn)抗體或補體的活力低下，將不能形成空斑。所以補體要新鮮，并宜將3只以上豚鼠血清混合。試驗中加入Ca2+、Mg2+是為了活化補體。7．空斑計數(shù)：要求判讀準確，避免辨認造成的誤差。遇可疑空斑時，應鏡檢，對肉眼結(jié)果進行核對。第15頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三所以器皿和各種試劑在加入表層基前均需預溫。SRBC可大致計數(shù)，但脾細胞計數(shù)必須