細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(jìshù)第一頁，共五十五頁。精選ppt

細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)。通過細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品(chǎnpǐn)都是從細(xì)胞得來，所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。什么(shénme)是細(xì)胞培養(yǎng)？第二頁，共五十五頁。精選ppt主要(zhǔyào)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)設(shè)備試劑及耗材清洗及滅菌(mièjūn)細(xì)胞培養(yǎng)（細(xì)胞生長(zhǎng)過程，細(xì)胞來源，細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存，細(xì)胞計(jì)數(shù)，活力測(cè)定，細(xì)胞污染）第三頁，共五十五頁。精選ppt一實(shí)驗(yàn)(shíyàn)設(shè)備超凈工作臺(tái)，生物安全柜CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡離心機(jī)電熱恒溫(héngwēn)水槽液氮罐純水儀壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱第四頁，共五十五頁。精選ppt

超凈臺(tái)生物(shēngwù)安全柜酒精燈（√），離開(líkāi)要熄滅！酒精燈（×）第五頁，共五十五頁。精選pptCO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定(shèdìnɡ)的條件為37℃，5％CO2

。倒置(dàozhì)顯微鏡第六頁，共五十五頁。精選ppt離心機(jī)電熱(diànrè)恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平第七頁，共五十五頁。精選ppt純水儀壓力蒸汽(zhēnɡqì)滅菌器電熱干燥箱由工作人員操作(cāozuò)，注意安全！第八頁，共五十五頁。精選ppt小結(jié)一實(shí)驗(yàn)設(shè)備(shèbèi)及功能超凈工作臺(tái)，生物安全柜------操作平臺(tái)CO2培養(yǎng)箱-------------------------細(xì)胞生長(zhǎng)的空間倒置(dàozhì)顯微鏡-------------------------觀察細(xì)胞離心機(jī)-------------------------------離心收集細(xì)胞電熱恒溫水槽----------------------加熱

液氮罐-------------------------------凍存細(xì)胞純水儀-------------------------------制備一級(jí)水壓力蒸汽消毒器--------------------滅菌電熱干燥箱-------------------------烘干器皿（酒精燈安全(ānquán)）第九頁，共五十五頁。精選ppt二試劑(shìjì)及耗材培養(yǎng)基緩沖液消化液血清(xuèqīng)其他耗材第十頁，共五十五頁。精選ppt培養(yǎng)基

供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)(shēngzhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。成分及作用：氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位碳水化合物：能量來源無機(jī)鹽：幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡維生素：維持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用第十一頁，共五十五頁。精選ppt培養(yǎng)基分類(fēnlèi)

DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纖維、上皮細(xì)胞（293），一些實(shí)體瘤（Panc-1），原代神經(jīng)元

DMEM（低糖，葡萄糖1000mg/L）：間充質(zhì)干細(xì)胞，單抗細(xì)胞融合

RPMI1640：血液(xuèyè)細(xì)胞（HL60）、一些實(shí)體瘤細(xì)胞（BT474）酚紅：PH指示劑（黃色過酸、紫色過堿）；酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），涉及(shèjí)到激素和誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，建議選用無酚紅培養(yǎng)基。ATCC/美國模式培養(yǎng)物集存庫第十二頁，共五十五頁。精選ppt緩沖液（洗滌(xǐdí)細(xì)胞）

PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有(jùyǒu)pH緩沖作用的等滲鹽溶液（常規(guī)實(shí)驗(yàn)皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸緩沖液，磷酸鹽含量稍低，含有鈣鎂離子，用于胚胎學(xué)方面的研究。

Hanks：平衡鹽溶液——無機(jī)鹽和葡萄糖濃度接近大部分動(dòng)植物細(xì)胞的水平，可作為動(dòng)植物細(xì)胞短期培養(yǎng)(幾個(gè)小時(shí))。

D-Hank’s：不含鈣離子、鎂離子、葡萄糖（使用消化液時(shí)）。第十三頁，共五十五頁。精選ppt消化液胰蛋白酶溶液

使細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞離散。使用濃度0.25%。配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清（對(duì)胰酶產(chǎn)生抑制作用）的平衡鹽溶液（如PBS、D-Hank’s）。EDTA溶液

一般用其鈉鹽，可溶性較好。有些組織需要Ca2+

、Mg2+來保持其完整性，EDTA可以螯合這些離子(lízǐ)，可使細(xì)胞之間裂解。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。膠原酶溶液主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分（用胰蛋白酶效果較差），使用Hanks溶液配置，常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）。第十四頁，共五十五頁。精選ppt提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長(zhǎng)因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸(jiēchù)和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞的起到某些保護(hù)作用。保存血清最好的方法？建議血清保存在-20℃。解凍后存放于4℃時(shí)，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。（分裝）如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議從冷凍箱取出后，置于2～8℃冰箱使之緩慢解凍、融解。使用時(shí)，必須將解凍的血清充分混勻，并且勿將血清置于37℃太久。

血清(xuèqīng)第十五頁，共五十五頁。精選ppt青霉素-鏈霉素溶液(róngyè)

青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml。分別阻止細(xì)菌細(xì)胞壁合成及細(xì)菌蛋白質(zhì)的組成，達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，防止(fángzhǐ)污染，對(duì)真菌和支原體無效。其他實(shí)驗(yàn)所需的試劑：藥物（如ATRA）、檢測(cè)試劑（如MTT）、細(xì)胞因子（如SCF）等第十六頁，共五十五頁。精選ppt試劑標(biāo)注(biāozhù)規(guī)范試劑名稱NaCl配制濃度0.5mM配制人張三(zhānɡsān)配制日期2016.10.21第十七頁，共五十五頁。精選ppt耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板離心管、移液管槍尖其他(qítā)第十八頁，共五十五頁。精選ppt小結(jié)二試劑及耗材的分類(fēnlèi)及用途培養(yǎng)基（成分、分類）緩沖液（PBS、Hanks等）消化液（分類及應(yīng)用）血清(xuèqīng)（作用、存儲(chǔ)及解凍方法）試劑標(biāo)簽要規(guī)范耗材（分類(fēnlèi)、用途）第十九頁，共五十五頁。精選ppt在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗(qīngxǐ)的培養(yǎng)用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（潔消精）、超聲波清洗、沖洗、烘干四個(gè)步驟）三清洗(qīngxǐ)及滅菌第二十頁，共五十五頁。精選ppt消毒滅菌(mièjūn)方法物理消毒滅菌法Co60輻射（γ射線）：破壞生物大分子（塑料制品）紫外線（200-300nm）：30min，阻止細(xì)菌、病毒核酸合成。（細(xì)胞室：用于空氣，操作臺(tái)表面等）濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min，破壞微生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、部分塑料耗材、手術(shù)器械等，由工作人員操作）干熱：160℃,2小時(shí)，高熱作用下的氧化作用破壞微生物（耐高溫的玻璃和金屬制品）過濾(guòl(fā)ǜ)：0.22μm濾膜過濾除菌（少量試劑）第二十一頁，共五十五頁。精選ppt消毒滅菌(mièjūn)方法化學(xué)消毒滅菌法75%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理（蛋白凝固）（不能擦拭有機(jī)玻璃(yǒujībōlí)）1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡，皮膚和操作室壁面的擦試消毒（陽離子表面活性劑，能破壞細(xì)胞膜，改變其通透性而起殺菌作用）第二十二頁，共五十五頁。精選ppt需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。清洗的步驟滅菌的方法：

-紫外線（超凈臺(tái)、生物安全柜）

-高壓蒸汽滅菌（準(zhǔn)備好放在準(zhǔn)備室502）

-75%酒精（表面(biǎomiàn)消毒，小心酒精燈明火）小結(jié)(xiǎojié)三清洗及滅菌第二十三頁，共五十五頁。精選ppt四細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)類型(lèixíng)細(xì)胞來源細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞傳代細(xì)胞凍存細(xì)胞計(jì)數(shù)(jìshù)活力測(cè)定污染種類第二十四頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)的生長(zhǎng)類型

粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。（絕大多數(shù)正常細(xì)胞及實(shí)體瘤細(xì)胞）

懸浮型細(xì)胞：不必(bùbì)附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。（主要是白血病細(xì)胞等）小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(xìbāo)第二十五頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)貼壁過程第二十六頁，共五十五頁。精選ppt每代貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)(shēngzhǎng)過程游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)(zhuàngtài)，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞體圓球形）貼壁期（細(xì)胞平均在10分鐘－4小時(shí)貼壁，底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等）潛伏期（有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂，一般為6～24小時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳。

最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究）停止期（平臺(tái)期）（細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性）（懸浮細(xì)胞沒有貼壁過程）第二十七頁，共五十五頁。精選ppt國內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方有哪些？ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫）國內(nèi)代理ECACC（歐洲細(xì)胞株、微生物保藏中心）國內(nèi)代理、sigma中國科學(xué)院細(xì)胞研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院（協(xié)和(xiéhé)醫(yī)科大學(xué)）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部武漢大學(xué)冷藏中心等細(xì)胞(xìbāo)來源第二十八頁，共五十五頁。精選ppt

確定細(xì)胞株的培養(yǎng)(péiyǎng)信息（ATCC）配制培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗）、胰酶、PBS無菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準(zhǔn)備準(zhǔn)備(zhǔnbèi)工作第二十九頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)復(fù)蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染(wūrǎn)情形。（2）用培養(yǎng)液稀釋后低速離心10分鐘。（3）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。（4）隔天換液，但貼壁細(xì)胞若未貼壁則勿需處理。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成(xíngchéng)大冰晶而損傷細(xì)胞。第三十頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)傳代

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去(xiàqù)的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。第三十一頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)傳代1懸浮細(xì)胞(xìbāo)傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶底時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。

2半貼壁細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。離心新鮮培養(yǎng)基懸浮鋪板第三十二頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)傳代3貼壁細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的0.25％的胰酶。

吸掉上清，加入(jiārù)PBS緩沖液洗滌，棄掉洗液，加入適量胰酶消化液，37℃消化1分鐘左右，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并離心去上清，重新稀釋后接種。注意：開放式操作，小心謹(jǐn)慎、謹(jǐn)防污染！第三十三頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凍存（慢凍）1細(xì)胞凍存液（1ml/管）基礎(chǔ)培養(yǎng)基70％胎牛血清20％DMSO10％（二甲基亞砜，一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷(sǔnshāng)。）2細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8x106cells/ml緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致(bùzhì)產(chǎn)生大的冰晶。第三十四頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凍存3慢凍程序傳統(tǒng)方法：4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時(shí)（或過夜）→液氮長(zhǎng)期保存。程序降溫盒：利用異丙醇實(shí)現(xiàn)梯度降溫（易揮發(fā)，并且易吸收空氣中的水分(shuǐfèn)，冷凍過程中可以輔助實(shí)現(xiàn)緩慢降溫，每十分鐘降一度）。第三十五頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凍存第三十六頁，共五十五頁。精選ppt小結(jié)(xiǎojié)四細(xì)胞培養(yǎng)過程細(xì)胞生長(zhǎng)類型及傳代方法(fāngfǎ)細(xì)胞培養(yǎng)過程注意無菌操作（全程）準(zhǔn)備工作復(fù)蘇（快）傳代（無菌）凍存（慢）實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞信息(xìnxī)、方法凍存液成分、培養(yǎng)基、耗材程序第三十七頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工(shǒugōng)計(jì)數(shù)細(xì)胞第三十八頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)計(jì)數(shù)計(jì)算公式：細(xì)胞(xìbāo)數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×

104第三十九頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)記上不記下，記左不記右。吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡。鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散(fēnsàn)不好，需重新制備細(xì)胞懸液。第四十頁，共五十五頁。精選ppt培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)活力測(cè)定

細(xì)胞活力測(cè)定是體外實(shí)驗(yàn)研究(yánjiū)中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。第四十一頁，共五十五頁。精選ppt培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞活力測(cè)定

1細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)(shíyàn)

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯?xì)胞的增殖能力?？寺⌒纬陕剩剑寺⌒纬蓴?shù)／接種細(xì)胞數(shù)）×100%優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠，適于貼壁細(xì)胞第四十二頁，共五十五頁。精選ppt培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)活力測(cè)定

2臺(tái)盼藍(lán)法（0.4%）細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色(zhuósè)。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活性。第四十三頁，共五十五頁。精選ppt培養(yǎng)細(xì)胞活力(huólì)測(cè)定

3四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)。原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤(zhǒngliú)放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。第四十四頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)胞培養(yǎng)的污染(wūrǎn)類型細(xì)菌(xìjūn)污染真菌污染支原體污染病毒污染非同種細(xì)胞污染化學(xué)污染第四十五頁，共五十五頁。精選ppt細(xì)菌(xìjūn)污染小鼠胃癌(wèiái)細(xì)胞的球菌感染第四十六頁，共五十五頁。精選ppt念珠菌污染(wūrǎn)真菌(zhēnjūn)污染絲狀菌污染(wūrǎn)第四十七頁，共五十五頁。精選ppt真菌(zhēnjūn)污染典型的霉菌污染，肉眼(ròuyǎn)看到白色的團(tuán)塊或白點(diǎn)，鏡下呈絲狀。400倍圖片第四十八頁，共五十五頁。精選ppt支原體污染(wūrǎn)支原體污染(wūrǎn)電鏡照片(X30k)，煎蛋狀和其他形狀

第四十九頁，共五十五頁。精選ppt

細(xì)菌和真菌污染多發(fā)生在傳代、換液、加樣等開放性操作之后。原代操作尤其注意！因此，細(xì)胞培養(yǎng)切記：“無菌”理念貫穿始終(shǐzhōng)，包括：器皿、器械、耗材、培養(yǎng)基、試劑、操作習(xí)慣。（一旦污染、立即棄用?。?/p>

如何避免(bìmiǎn)污染？細(xì)節(jié)決定成敗(chéngbài)！第五十頁，共五十五頁。精選ppt小結(jié)五實(shí)驗(yàn)(shíyàn)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法細(xì)胞活力測(cè)定的方法分類、原理及應(yīng)用注意防止(fángzhǐ)細(xì)胞污染第五十一頁，共五十五頁。精選ppt總結(jié)(zǒngjié)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備的類型及功能試劑及耗材的分類及各自用途清洗物品的過程及滅菌的方法細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)過程，細(xì)胞來源細(xì)胞培養(yǎng)過程（復(fù)蘇、傳代(chuándài)及凍存）細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定方法注意無菌操作，防止細(xì)胞污染

第五十二頁，共五十五頁。精選ppt實(shí)驗(yàn)中心(zhōngxīn)細(xì)胞培養(yǎng)室