細(xì)胞工程及其應(yīng)用

關(guān)于細(xì)胞工程及其應(yīng)用第1頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)細(xì)胞工程的基本概念與技術(shù)第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用第三節(jié)植物細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用第四節(jié)微生物細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用(略)本章主要內(nèi)容第2頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三一、細(xì)胞工程（Cellengineering）定義是指以細(xì)胞為基本單位，在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖，或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁育動(dòng)、植物個(gè)體，以獲得某種有用的物質(zhì)的過程。第一節(jié)細(xì)胞工程的基本概念與技術(shù)第3頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三所涉及的主要技術(shù)有：細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞拆分技術(shù)染色體工程胚胎工程等等二、細(xì)胞工程的基本技術(shù)第4頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：是指使動(dòng)物、植物在體外無菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下分裂、生長(zhǎng)的一門技術(shù)。一般是將有機(jī)體內(nèi)的某一組織取出，經(jīng)處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞，并接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂。第5頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三植物細(xì)胞培養(yǎng)第6頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三2、細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)（cellfusiontechnology）：是指通過人工方法使遺傳性狀不同的原生質(zhì)體（除去細(xì)胞壁的細(xì)胞）相互接觸后發(fā)生融合，導(dǎo)致染色體等遺傳物質(zhì)重組并形成新物種或新品種的技術(shù)，又稱體細(xì)胞雜交。第7頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞融合的優(yōu)點(diǎn):克服種屬間雜交的“不育性”，可進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交基因重組頻率高，重組類型多?？蓪⒂善渌N方法獲得的優(yōu)良性狀，經(jīng)原生質(zhì)體融合而組合到一個(gè)細(xì)胞中可以是兩個(gè)以上親株同時(shí)參與融合，可形成多種性狀的融合子第8頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三生物學(xué)法：仙臺(tái)病毒（HVJ）法?；瘜W(xué)融合劑法：聚乙二醇（PEG）法。電處理融合法：利用細(xì)胞融合儀。促進(jìn)細(xì)胞融合的方法:第9頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞融合的基本過程:主要過程包括三方面:1、制備原生質(zhì)體原生質(zhì)體：指那些已去除細(xì)胞壁的細(xì)胞，細(xì)胞外僅由細(xì)胞膜包裹，呈圓形，要在高滲液中才能維持細(xì)胞的相對(duì)穩(wěn)定。2、誘導(dǎo)細(xì)胞融合3、篩選融合子（來自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的融合重組子）第10頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三第12頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三Zimmermann教授的燕麥原生質(zhì)體的融合圖像

第14頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程及其應(yīng)用一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是將動(dòng)物細(xì)胞或組織從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，并給予必要的生長(zhǎng)條件，模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使細(xì)胞在體外繼續(xù)生長(zhǎng)和增殖的過程。在整個(gè)過程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。第15頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三動(dòng)物細(xì)胞工程概述動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體制備應(yīng)用胚胎移植核移植第16頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本概念培養(yǎng)液的成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等原代培養(yǎng)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞傳至十代左右傳代培養(yǎng)：經(jīng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞可傳40到50代。細(xì)胞株：10到40、50代的細(xì)胞，遺傳物質(zhì)沒發(fā)生改變。細(xì)胞系：超過50代的細(xì)胞，遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，可無限增殖。第17頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：直接采用動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織中提取成分作為培養(yǎng)液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。合成培養(yǎng)基：主要是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽等，一般都加入一定量的血清。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基:成分有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子（胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、生長(zhǎng)因子和激素等）。第18頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三第19頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程胚胎成幼齡動(dòng)物的組織器官（細(xì)胞來源）單個(gè)細(xì)胞原代細(xì)胞細(xì)胞株細(xì)胞系剪碎胰蛋白酶分離細(xì)胞洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變）（遺傳物質(zhì)發(fā)生改變）第21頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)制品，（如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體、動(dòng)物激素）檢測(cè)有毒物質(zhì)用于某些器官移植第22頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三動(dòng)物細(xì)胞融合仙臺(tái)病毒喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）紫外線物理法化學(xué)法生物法第23頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三融合過程示意圖第24頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三單克隆抗體的概念單:單個(gè)細(xì)胞克隆:無性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)第25頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三實(shí)驗(yàn)?zāi)康?制備單克隆抗體.實(shí)驗(yàn)原理：B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生抗體，骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖，雜交瘤細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體又能無限增殖。實(shí)驗(yàn)材料：小白鼠實(shí)驗(yàn)器材：培養(yǎng)皿、針筒等等。實(shí)驗(yàn)過程：如下頁根據(jù)阿根廷科學(xué)家米爾斯坦和德國(guó)科學(xué)家柯勒設(shè)計(jì)的。其實(shí)驗(yàn)方案:第26頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三單克隆抗體制備過程第27頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三簡(jiǎn)要介紹單克隆抗體的制備過程

1、免疫動(dòng)物

免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的過程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。第28頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三2、細(xì)胞融合采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。簡(jiǎn)要介紹單克隆抗體的制備過程

第29頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三3、選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。簡(jiǎn)要介紹單克隆抗體的制備過程

第30頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。簡(jiǎn)要介紹單克隆抗體的制備過程

第31頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三5、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。(1)體內(nèi)誘生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。簡(jiǎn)要介紹單克隆抗體的制備過程

第32頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三(2)體外培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。簡(jiǎn)要介紹單克隆抗體的制備過程

第33頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三簡(jiǎn)要介紹單克隆抗體的制備過程雜交瘤細(xì)胞融合后，要進(jìn)行篩選后才能使用。雜交瘤細(xì)胞分為兩次：一、篩選出雜交瘤細(xì)胞;二、在初選的雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜家瘤細(xì)胞，這兩次篩選的方法和原理各不相同。第34頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三第35頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體流程第36頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三單克隆抗體的應(yīng)用主要用于疾病的診斷、治療和預(yù)防。與常規(guī)抗體相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細(xì)菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士，能識(shí)別“自己”與“異己”，一旦發(fā)現(xiàn)致病因素便與之結(jié)合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導(dǎo)彈”，將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在部位，既消滅了癌細(xì)胞又不會(huì)傷害健康細(xì)胞。第37頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三因無細(xì)胞壁，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞需附著在固體或半固體表面才能生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較苛刻，除了需要與微生物、植物細(xì)胞一樣的培養(yǎng)基成分外，一般需要血清或動(dòng)物激素對(duì)環(huán)境更敏感，培養(yǎng)條件的控制更嚴(yán)格生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)反應(yīng)器要求要長(zhǎng)時(shí)間適應(yīng)無菌狀態(tài)培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)：第38頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法1、懸浮培養(yǎng)法2、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法3、固定化細(xì)胞培養(yǎng)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法－微載體培養(yǎng)第39頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三生產(chǎn)疫苗生產(chǎn)生物活性物質(zhì)動(dòng)物干擾素、人體干擾素、人的單克隆抗體、免疫球蛋白、生長(zhǎng)激素等的生產(chǎn)?；蚬こ碳?xì)胞培養(yǎng)食品：美國(guó)和荷蘭科學(xué)家成功培養(yǎng)出人造肉四、動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的應(yīng)用第40頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三附：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物

疫苗人小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗等

動(dòng)物牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、雞痘病疫苗、豬霍亂疫苗、牛疫狂犬疫苗、草魚出血熱疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑β-細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、白細(xì)胞介素、胸腺素、巨噬細(xì)胞毒力因子等酶尿激酶、天門冬氨酰胺酶、膠原酶、細(xì)胞色素P、450、纖維蛋白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脫羥酶等激素絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、促濾泡激素、生長(zhǎng)激素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、促黃體激素等第41頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三思考與探究：如何用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為燒傷病人植皮？

取該患者的皮膚進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),獲得足量的細(xì)胞后再移植第42頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三一、植物細(xì)胞培養(yǎng)的理論依據(jù)及研究進(jìn)展1、理論依據(jù)：細(xì)胞學(xué)說:認(rèn)為植物和動(dòng)物都是由細(xì)胞構(gòu)成的，細(xì)胞進(jìn)行分裂而增多，并組建成生物體。并指出如果所具備的條件能同在活體內(nèi)的一樣，每個(gè)細(xì)胞都應(yīng)能獨(dú)立生存和發(fā)展。植物細(xì)胞具有全能性的學(xué)說:認(rèn)為每個(gè)植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。第三節(jié)植物細(xì)胞工程及其應(yīng)用第43頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三2、進(jìn)展（與食品有關(guān)部分）：二十世紀(jì)80年代，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)各種生物制品已陸續(xù)投放市場(chǎng)。目前，全世界已對(duì)近千種植物進(jìn)行過細(xì)胞培養(yǎng)研究，并且采用大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)其代謝產(chǎn)物，包括藥品、香料、色素、食品和化妝品等共500多種。第44頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)基中的物質(zhì)可以概括為五類：（1）無機(jī)營(yíng)養(yǎng)：各種鹽類（大量元素和微量元素）。（2）有機(jī)營(yíng)養(yǎng)：主要有糖類、氨基酸和維生素。（3）植物生長(zhǎng)激素：生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素兩類。（4）天然附加物：植物的天然汁液、瓊脂糖等。（5）水（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)基二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)和方法第45頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三植物細(xì)胞工程的發(fā)展歷史植物細(xì)胞工程技術(shù)的研究始于1902年德國(guó)植物學(xué)Haberlandt,至今已有近百年歷史。它的發(fā)展分為如下幾個(gè)階段：探索階段(1902-1929年)技術(shù)建立階段(1930-1940年)器官形成和個(gè)體發(fā)生階段(1941-1959年)技術(shù)迅速發(fā)展階段(1960-現(xiàn)在)第46頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三探索階段（1902—1929年）1902年，Haberlandt根據(jù)細(xì)胞理論大膽地提出：高等植物的體細(xì)胞，可以不斷分割，直至單個(gè)細(xì)胞的理論。預(yù)言體細(xì)胞在適宜條件下，具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。為了論證這一觀點(diǎn)，他在加入了蔗糖的Knop溶液中培養(yǎng)單個(gè)離體細(xì)胞，所選用的材料是小野芝麻和風(fēng)眼蘭的表皮細(xì)胞、葉柵欄組織、表皮細(xì)胞、毛、刺細(xì)胞等。遺憾的是，雖然在柵欄細(xì)胞中他明顯看到了細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞壁的加厚和淀粉的形成等，但沒有一個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)中能夠發(fā)生分裂。

第47頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三1904年，Hannig在添加有無機(jī)鹽和有機(jī)成分的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)蘿卜和辣根的幼胚，得到了充分發(fā)育的胚并提前萌發(fā)成小苗。這是離體培養(yǎng)的第一個(gè)成功例子。1922年，Kotte和Robbins離體培養(yǎng)根尖獲得成功，并在含有無機(jī)鹽，葡萄糖或果糖、瓊脂的培養(yǎng)基上使1.45-3.75cm的豌豆、玉米、棉花莖尖、根尖培養(yǎng)成苗。1925年，Laibach培養(yǎng)亞麻種間雜交幼胚獲得成功并得到雜種（近年在遠(yuǎn)緣雜交或不能形成種子的植物上用得最多，熟稱胚挽救）。第48頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三探索階段取得的成果自Haberlandt的實(shí)驗(yàn)之后，直到1934年White培養(yǎng)番茄離體根尖的成功，在其間的32年時(shí)間里，植物離體培養(yǎng)技術(shù)幾乎沒有什么進(jìn)展，只是在以下兩個(gè)方面進(jìn)行了一些初步的探索：一個(gè)方面是胚培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，1904年Hannig在無機(jī)鹽和蔗糖溶液中培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，并使這些胚在離體條件下長(zhǎng)到成熱。后來，Laibach(1925，1929)把由亞麻種間雜交形成的不能成活的種子中的胚剖出，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)至成熟，從而證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)緣雜交中利用的可能性；另—方面是根培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，1922年，美國(guó)的Robbins和德國(guó)的Kotte分別報(bào)道培養(yǎng)離體根尖獲得某些成功，這是有關(guān)根培養(yǎng)的最早的實(shí)驗(yàn)。第49頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三技術(shù)建立階段（1930—1940）1933年，李繼侗將3mm以上的銀杏胚培養(yǎng)成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)加入胚乳汁可以促進(jìn)離體胚的生長(zhǎng)。1934年，Gautberet培養(yǎng)三毛柳、黑楊的形成層，成功地得到愈傷組織。培養(yǎng)基是Knop液加葡萄糖、酵母提取物、水解酪蛋白的固體培養(yǎng)基。同年（1934年），White將番茄根尖細(xì)胞離體培養(yǎng)，得到一個(gè)活躍分裂的單細(xì)胞無性系。這個(gè)無性系一直培養(yǎng)到20世紀(jì)60年代（共30多年）。1937年，White發(fā)現(xiàn)B族維生素、吲哚乙酸對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。發(fā)明了第一個(gè)人工合成培養(yǎng)基。1937-1938年，Nabecourt使胡蘿卜根組織經(jīng)培養(yǎng)而獲得愈傷組織并繼代培養(yǎng)了幾十年。1939年，White培養(yǎng)煙草的形成層獲得愈傷組織。同時(shí)使愈傷組織繼代培養(yǎng)獲得成功。這一階段，人們對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的分裂和不分裂的原因尚不能解釋，但在李繼侗銀杏幼胚培養(yǎng)中，由于加入胚乳汁而促進(jìn)了幼胚發(fā)育的啟迪下，人們開始注意到離體培養(yǎng)條件下的營(yíng)養(yǎng)需要。第50頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三器官形成和個(gè)體發(fā)生階段（1941—1959）1941年，Overbeek等以椰子乳汁作為培養(yǎng)基補(bǔ)加物，使曼陀羅心形期幼胚培養(yǎng)成功。1946年，羅士韋將菟絲子莖尖培養(yǎng)成功并在試管內(nèi)開花。從此給人們以啟迪，離體培養(yǎng)技術(shù)可以控制花芽的形成。1948年，Skoog和崔徵在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官發(fā)生的研究中，發(fā)現(xiàn)腺嘌嶺和腺苷可以解除培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素(IAA)對(duì)芽形成的抑制作用而誘導(dǎo)芽形成。生長(zhǎng)素和腺嘌嶺的比例是控制芽或根形成的重要條件。1951年，Nitsch將果實(shí)、子房、未受精的胚珠、以及花器官的各個(gè)部分培養(yǎng)成功。第51頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三1953年，Muir將萬壽菊和煙草的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，放在往復(fù)式搖床上振蕩，獲得由單細(xì)胞或細(xì)胞聚集體組成的細(xì)胞懸浮液，而且可以繼代繁殖。這是培養(yǎng)方式的突破。1956年，Miller為了尋找細(xì)胞分裂物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了激動(dòng)素(6-糠基氨基瞟嶺)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)激動(dòng)素代替腺嘌呤促進(jìn)生芽，其效果增加3萬倍。1958年，Steward和Shantz用胡蘿卜根韌皮部細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，從中誘導(dǎo)出胚狀體并使其發(fā)育成完整小植株。第一次證實(shí)Haberlandt提出的細(xì)胞全能性學(xué)說。第52頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三技術(shù)迅速發(fā)展階段（1960—現(xiàn)在）1960年，Cocking用纖維索酶和果膠酶溶解了番茄根尖的細(xì)胞壁，得到了原生質(zhì)體。繼續(xù)培養(yǎng)原生質(zhì)體，可重新長(zhǎng)壁、分裂、分化形成根和芽，最終形成植物體。1960年，Kanata、RanganWamy和Mahshwari培養(yǎng)罌粟未受精的胚珠并在試管內(nèi)撒播花粉，成功地獲得能正常發(fā)芽的種子。1964-1966年，Guha和Maheshwan培養(yǎng)毛葉曼陀羅的花藥，得到由花粉發(fā)育來的單倍體植株。第53頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三1972年，Carlson在培養(yǎng)兩個(gè)不同種的粉藍(lán)煙草(Nicotianaglanca)和郎氏煙草(N.langsdorfii)原生質(zhì)體時(shí)，加入誘導(dǎo)劑(甘露醇、鹽類)，使兩種原生質(zhì)體發(fā)生融合，得到了細(xì)胞雜種，而且該細(xì)胞雜種經(jīng)細(xì)胞分裂、分化形成完整的雜種植物。隨后由加籍華人高國(guó)楠在聚乙二醇(PEG)的誘導(dǎo)下，使大豆和粉藍(lán)煙草(科間)融合成功，而且得到3％的異核體。單離培養(yǎng)異核體2—3個(gè)月，可分裂出幾百萬個(gè)細(xì)胞。1974年，Bonne和Eriksson成功地完成了細(xì)胞器(葉綠體)的攝入。將具有葉綠體的海藻和不具有葉綠體的胡蘿卜根原生質(zhì)體，在聚乙二醇誘導(dǎo)下融合成功。觀察到16％的活胡蘿卜原生質(zhì)體中，含1至多個(gè)葉綠體。試驗(yàn)證明原生質(zhì)體是引入外源遺傳物質(zhì)的極好材料，為基因工程奠定良好基礎(chǔ)。第54頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三（二）、植物細(xì)胞培養(yǎng)方法按培養(yǎng)對(duì)象分：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)按培養(yǎng)基分：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)按培養(yǎng)系統(tǒng)分：懸浮培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)第55頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三1、

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是指把游離的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的增殖培養(yǎng)。在懸浮培養(yǎng)中，應(yīng)使細(xì)胞增殖速度快、有效成分含量高、分散程度大，游離細(xì)胞盡可能的多，利于細(xì)胞增殖和產(chǎn)物的生成。需要進(jìn)行植物懸浮細(xì)胞系的建立。

第56頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三

①優(yōu)良的愈傷組織的獲得

（1）、

植物懸浮細(xì)胞系的建立是植物懸浮細(xì)胞體系建立的關(guān)鍵。愈傷組織：是指由外植體（離體植物材料如芽等）組織的增生細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏松排列的薄壁細(xì)胞。（可傳代的未分化的細(xì)胞團(tuán)）。胡蘿卜的愈傷組織菠蘿的愈傷組織從草坪草愈傷組織再生出新的植株。

第57頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三獲得愈傷組織的過程：選擇合適的植物材料表面消毒無菌條件下切取外植體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)長(zhǎng)出愈傷組織分割愈傷組織固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)優(yōu)良的愈傷組織：顆粒細(xì)小、疏松易碎、細(xì)胞生長(zhǎng)快、有效成分含量高。第58頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三植物細(xì)胞脫分化、再分化圖成熟細(xì)胞分生細(xì)胞多細(xì)胞團(tuán)(愈傷組織)胚胎發(fā)生器官分化完整植株RedifferentiationDedifferentiation第59頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三愈傷組織葉基葉基在脫分化菠蘿的脫分化第60頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三愈傷組織不定芽再生菠蘿的再分化第61頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三生根菠蘿的再分化第62頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三菠蘿再生植株葉的培養(yǎng)第63頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三影響植物細(xì)胞脫分化和再分化因子影響因子滲透壓酸堿度溫度濕度光照無機(jī)鹽類有機(jī)物類植物激素天然復(fù)合物環(huán)境條件培養(yǎng)基的組成（營(yíng)養(yǎng)條件）內(nèi)因外因遺傳特性生理狀態(tài)第64頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三完整植株的形成外植體脫分化體細(xì)胞胚愈傷組織再分化再分化器官發(fā)生完整植株第65頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三②、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系應(yīng)滿足的基本條件懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)小（30~50細(xì)胞以下）。細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，均一性好。細(xì)胞生長(zhǎng)速度快。第66頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三分批培養(yǎng)法：生產(chǎn)周期一般需6天以上。半連續(xù)培養(yǎng)法：生產(chǎn)周期近１個(gè)月。連續(xù)培養(yǎng)法：生產(chǎn)周期可達(dá)2~3個(gè)月。（２）、

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法第67頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三

光照有的需要需要植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較第68頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三三、植物細(xì)胞培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應(yīng)用1983年，日本三井石化公司首先利用紫草細(xì)胞培養(yǎng)商業(yè)化生產(chǎn)紫草寧。目前，全世界已對(duì)近千種植物進(jìn)行過細(xì)胞培養(yǎng)研究，并采用大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)其代謝產(chǎn)物，包括藥品、香料、色素、油料、甜味劑、抗氧化劑等，其中許多產(chǎn)物已在醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)及林業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。第69頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三

生產(chǎn)實(shí)例：西洋參細(xì)胞培養(yǎng)

1、植物細(xì)胞的生產(chǎn)西洋參原產(chǎn)于北美洲，屬五加科人參屬植物，為名貴的中藥材，具有降血脂、鎮(zhèn)靜、造血及健胃作用，所含主要有效成分為人參皂苷，目前尚不能人工合成。西洋參生長(zhǎng)緩慢，一般需4~6年才能收獲入藥，且西洋參種子資源稀少，價(jià)格昂貴，因此利用西洋參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法生產(chǎn)西洋參細(xì)胞和人參皂甙，具有十分重要的意義。第70頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三

乙醇消毒誘導(dǎo)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)

西洋參根無菌根愈傷組織

大量培養(yǎng)過濾懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)酵液細(xì)胞

干燥西洋參細(xì)胞干粉成品

收率：一般為3～5g／L（干重）

西洋參細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程：第71頁，講稿共77頁，2023年5月2日，星期三2、初級(jí)及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物（Secondarymetabolites，又稱為次生代謝物、二代謝物）是不直接涉及到生命正常生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖的有機(jī)化合物。不像初級(jí)代謝產(chǎn)物，缺少次級(jí)代謝產(chǎn)物不會(huì)導(dǎo)