熒光漂白恢復(fù)技術(shù)PPT

關(guān)于熒光漂白恢復(fù)技術(shù)PPT第1頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三FRAP關(guān)鍵技術(shù)簡介FRAP是用來測定活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。FRAP是上世紀(jì)70年代開創(chuàng)的利用熒光標(biāo)記法研究活體細(xì)胞中各類分子遷移特性的技術(shù)。當(dāng)前生命科學(xué)研究已進(jìn)入分子水平，應(yīng)用多種手段已獲得大量關(guān)于細(xì)胞內(nèi)分子的定性知識(shí)，基本了解了各細(xì)胞器的分子組成，找到許多在細(xì)胞生命周期中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，確認(rèn)了許多重要蛋白質(zhì)之間相互作用的存在并初步描繪出一些信號(hào)通路。但細(xì)胞的各種生物學(xué)功能和現(xiàn)象都是借助相關(guān)分子實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)前的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)就集中于解答分子實(shí)現(xiàn)各種功能的機(jī)制。這就需要掌握活細(xì)胞生理狀態(tài)下分子運(yùn)動(dòng)的各種信息，近年來發(fā)展的一些技術(shù)手段為獲得有關(guān)重要信息提供了有力的工具，F(xiàn)RAP技術(shù)就是其中一種重要方法。第2頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三FRAP原理InFRAP,aregionofthecellisexposedtohigh-intensitylaserlight,causingthefluorophoreswithinthatregiontoirreversiblylosetheirabilitytofluoresce.Recoveryoffluorescenceinthatregionyieldsinformationaboutmoleculardiffusionandbindinginthecell.第3頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三FRAP技術(shù)的基本要求選擇合適的熒光探針具備精確可控的激光激發(fā)和熒光檢測設(shè)備

激光掃描共聚焦顯微鏡第4頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三FRAP的三個(gè)階段用盡可能弱的激光掃描全細(xì)胞使用強(qiáng)激光在短時(shí)間內(nèi)掃描漂白區(qū)域用盡可能弱的激光掃描全細(xì)胞漂白前漂白漂白后恢復(fù)第5頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三注：漂白前和漂白后恢復(fù)都用盡可能弱的激光掃描全細(xì)胞，目的是得到掃描圖像而不引起熒光淬滅，漂白階段則使用強(qiáng)激光在短時(shí)間內(nèi)掃描漂白區(qū)域，目的是使區(qū)域內(nèi)的熒光全部淬滅。在整個(gè)過程中，監(jiān)測漂白區(qū)域在各時(shí)間段的熒光強(qiáng)度變化并繪制曲線，從恢復(fù)曲線及其數(shù)據(jù)就可以得到關(guān)于分子遷移速率、動(dòng)態(tài)分子比例等信息。第6頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三FRAP實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)做FRAP實(shí)驗(yàn)還應(yīng)當(dāng)注意以下幾點(diǎn)，否則就易得到錯(cuò)誤結(jié)果。

（1）注意實(shí)驗(yàn)溫度的控制。（2）漂白區(qū)域大小的選擇和熒光恢復(fù)檢測時(shí)間的長短要根據(jù)具體情況而定。（3）激發(fā)光的波長和強(qiáng)度應(yīng)不會(huì)使細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷；盡量減少漂白前和漂白后的熒光淬滅。第8頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三FRAP技術(shù)的不足之處第一,它只能檢測膜蛋白的群體移動(dòng),而不能觀察單個(gè)蛋白的移動(dòng)。其次,它不能證明膜蛋白在移動(dòng)時(shí)是否受局部條件的限制。第9頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三FRAP

的應(yīng)用第10頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三熒光漂白恢復(fù)測定巨噬細(xì)胞Fc受體的熒光恢復(fù)率和運(yùn)動(dòng)分?jǐn)?shù)

（山東大學(xué)碩士學(xué)位論文《熒光漂白恢復(fù)測定巨噬細(xì)胞Fc受體的流動(dòng)性》，李建業(yè)，2005.5）采用Alexa488標(biāo)記的羊抗鼠IgG間接標(biāo)記巨噬細(xì)胞Fc受體，用激光共聚焦系統(tǒng)的強(qiáng)脈沖激光漂白，弱強(qiáng)度激光掃描，光電倍增管(PMT)檢測，F(xiàn)luoview軟件記錄數(shù)據(jù)并分析處理。第11頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三漂白區(qū)域的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化示于圖2.11。第12頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三漂白以后恢復(fù)過程熒光強(qiáng)度的變化示于圖2.13。第13頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三漂白區(qū)域在漂白前后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化示于圖2.14。

說明：細(xì)胞膜具有流動(dòng)性，膜表面上Fc受體能夠遷移。第14頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三ProteinDiffusioninMammalianCellCytoplasm

（PLoSONE|August2011|Volume6|Issue8|e22962）Methods1.CellcultureNordenlaboratoryfelinekidney(NLFK)andHeLacellsweregrowninDulbecco’smodifiedEaglemedium(DMEM)supplementedwith10%fetalbovineserum(Gibco,Paisley,UK)at37℃inthepresenceof5%CO2.

2.FRAPexperimentsTheFRAPexperimentswereperformedonalaserscanningconfocalmicroscopeFV1000withanIX-81microscopeframe(Olympus,Tokyo,Japan)usinganOlympusUPLSAPO606(NA=1.2)waterimmersionobjective.Thesamplestagewasheatedto37uCpriortheexperiments.Toimagethecellgeometry,aconfocalstackwasacquiredbeforeandaftertheFRAPexperiment.Thevoxelsizewasadjustedto(200nm)3or(150nm)3.Thepinholesizewasadjustedto1Airyunit.The514nmlaserlinewasusedforEYFPexcitationandtheemittedfluorescencewasdetectedusinga530–600nmbandpassfilter.Imagingwasperformedwithalaserintensityof0.1–2Forbleachingacircular(r=1.85mmand2.83mm)regionofinterest(ROI)wasdefinedinthemiddleofthecytoplasm.AsbleachingtimesinFRAPareusuallyratherlargecomparedtothetimescalesofthemeasureddiffusionprocesses,theregionofthecell,whichisactuallybleached,isusuallylargerthanthedefinedROI.Thesizeoftheactuallybleachedregionanditsintensitydistributionweremeasuredbybleachingfixedcells(Fig.1).ImageJ[32]wasthenusedtoconstructanaverageshapeandintensityprofileofthatregion.第15頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三ThedurationofthebleachprocesswasmeasuredbyperformingFRAPexperimentsinwhich10imageswerecollectedbeforethebleachpulseand1afterthepulse.Thebleachtimewasextractedbymeasuringthetimewhentheframesimmediatelybeforeandafterthebleachpulseweretaken.Theaverageimagingtimeofoneframewassubtracted,andthedurationofthebleachprocesswasplottedasafunctionofiterations(bleachingtime),yieldingalinearslope.IntheLSCMused(OlympusFV1000),theshortestpossiblebleachprocedure(1iteration)lasted36mswithanadditionalrelayof18msbeforethenextimagescan,amountingto54msfortheentireprocess.Toachieveenoughbleachingforthedataanalysis,10iterationswereperformed(Fig.2),andthelaserintensitywassetto100%byusinganacousto-opticaltunablefilter.3.

ImageprocessingTherawimagesoftheconfocalmicroscopewereconvertedto8-bitgreyscaleimages.Onlylinearadjustmentsoftheimagebrightnessandcontrastwereperformed,avoidingsaturation.Thegray-scaleimageswerecoloredwithanappropriatelook-uptableandconvertedtoRGBimages.4.ConventionalFRAPanalysis第16頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三Figure1.FRAPexperimentinanNLFKcellstablyexpressingEYFP.(a)Theaverage(n=10)bleachprofilemeasuredonfixedcellsexpressingEYFP.Scalebar2mm.(b)Fluorescencedistributionbeforethebleachpulseandthepositionofthecircularbleacharea(diameter20pixels,FWHM3.7mm).Subsequentimagesshowthefluorescencedistributionimmediately(t=0ms),and250msand1safterthebleachpulse.Scalebar10mm.(c)Themeasuredrecoverycurve(Axelrodnormalization)andafitbythefree-diffusionmodelofSoumpasis.doi:10.1371/journal.pone.0022962.g001第17頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三FRAPanalysisWeperformedFRAPexperimentsonEYFP-expressingNLFKandHeLacells.WhenthemeasuredrecoverydatawereanalyzedbytheSoumpasismethod,wefoundacytoplasmdiffusioncoefficientofD~0:75+0:3mm2/s(n=8)fortheNLFKcellsandD~1:83+0:28mm2/s(n=13)fortheHeLacells.Thedifferenceintheliquidphaseproperties(‘viscosity’)ofthesecellsisstatisticallysignificant(pv0:05),whichindicatesthattheyhavedifferentmacromolecularconcentrations.Theaveragecytoplasmdiffusioncoefficients,SDcpT,were15:5+2:7mm2/sfortheNLFKand20:6+5:0mm2/sfortheHeLacells,beingthusquitesimilar.Inbothcelllinesthecytoplasmdiffusioncoefficient,Dcp(r),variedsignificantly(Fi