對遺傳學診斷的分析論文

第第頁對遺傳學診斷的分析論文一、運用單細胞雙重巢式PCR和MDA技術(shù)方法行性連鎖遺傳病診斷

1、提取男女單個淋巴細胞各150例，共300個細胞。隨機分成3組，每組男女細胞各50個，雙重巢式PCR技術(shù)在單細胞水平同時擴增X類固醇硫酸脂酶基因(steroidsulfatasegene，STS)/Y假基因和牙釉質(zhì)基因(Amelogenin，AMEL)，對比組用單重巢式PCR技術(shù)在單細胞水平分別擴增兩基因，比較單、雙重巢式PCR技術(shù)在單細胞水平的擴增率及性別診斷正確率。

2、應用MDA擴增5個單個淋巴細胞和10個單個卵裂球全基因組DNA，1%的瓊脂糖電泳檢測擴增效率，通過一般PCR即上述巢式PCR的其次輪的PCR條件檢測細胞性別來推斷擴增產(chǎn)物的均一性。結(jié)果1、單重巢式PCR擴增男性細胞STS和AMEL的擴增率和細胞性別診斷的正確率分別是84%、76%和84%、84%;而雙重巢式PCR技術(shù)同時擴增上述基因的擴增率和性別診斷正確率分別為98%、96%。后者與前兩者相比擴增率和性別診斷正確率均明顯提高，差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05、P0.01)。

3、MDA擴增5個淋巴細胞(3個為男性細胞，2個為女性細胞)全部擴增勝利，擴增率100%;MDA擴增10個卵裂球有4個擴出產(chǎn)物，擴增率為40%。以MDA產(chǎn)物為模板，用STS的其次輪引物檢測單個淋巴細胞性別，正確性為100%;檢測全部擴出產(chǎn)物的卵裂球也均能檢測出性別，發(fā)覺2個為男性，2個為女性，惋惜的是這4個卵裂球均來自不同的胚胎，所以不能互相驗證。從淋巴細胞MDA產(chǎn)物檢測的結(jié)果可以推斷MDA產(chǎn)物也是均一的。結(jié)論1、在單細胞水平性連鎖遺傳疾病診斷中，雙重巢式PCR技術(shù)較單重巢式PCR技術(shù)具有較高的擴增率及診斷正確率，并有助于發(fā)覺等位基因脫扣(alleledropout，ADO)。該法在無創(chuàng)性單基因伴性遺傳病的產(chǎn)前診斷和植入前遺傳學診斷中具有較高的實際應用價值，且經(jīng)濟、便捷，值得臨床進一步推廣。

4、初步預試驗可知MDA可以克服單細胞的模板量少和不行重復試驗的缺點。但由于此次預試驗的樣本量太小，其穩(wěn)定性、牢靠性還需進一步摸索，才可以用于單基因病的著床前遺傳學診斷和產(chǎn)前診斷。

二、利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行無創(chuàng)性地中海貧血產(chǎn)前基因診斷的討論

方法：收集157例孕婦的外周血，利用柱汲取的方法提取血漿中的cffDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分別富集小片段cffDNA，使用二重PCR反應(dulexPCR)檢測SRY基因和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceroldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH)基因。結(jié)果來源于86例孕男胎的孕婦血漿標本的小片段cffDNA均檢出SRY和GAPDH基因，來源于71例孕女胎的孕婦血漿標本的小片段cffDNA只檢出GAPDH基因。與絨毛/羊水標本檢測結(jié)果以及產(chǎn)后隨訪結(jié)果相符。特異性和敏感性分別為100%(157/157)和100%(86/86)。結(jié)論利用瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，可以選擇性富集孕婦外周血中的小片段cffDNA，相對地提高胎兒DNA的含量，結(jié)合二重PCR擴增SRY基因技術(shù)可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前性連鎖遺傳疾病和單基因突變疾病的產(chǎn)前診斷。其次部分利用孕婦外周血漿中cffDNA進行STRPCR檢測胎兒基因型目的：利用小片段cffDNA進行D5S818、D7S820、D13S317三個短串聯(lián)重復序列(shorttandemrepeat，STR)基因型的分析，觀看提取出來的小片段cffDNA中母源性DNA背景對試驗的影響。

方法：收集了62例孕婦外周血標本，提取小片段游離胎兒DNA，利用多重PCR(mutilplexPCR)的方法分析胎兒的.STR基因型，并與父母基因型相比對。結(jié)果：62例小片段cffDNA的擴增結(jié)果中，49例標本的擴增結(jié)果完全與父母基因型相匹配，未發(fā)覺母源性DNA的污染。其余13例在D13S317基因座的擴增中消失了母源性DNA的污染。

結(jié)論：經(jīng)過對小片段cffDNA進行富集后，仍有可能消失母源性DNA對試驗的影響，并且可能影響對試驗結(jié)果的判讀。使用多重PCR反應結(jié)合多基因座的擴增，可能可以有助于削減母源性DNA的影響，有助于結(jié)果的判讀。第三部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行β地中海貧血無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷目的：利用cffDNA對胎兒進行廣西、廣東地區(qū)常見的17種β地中海貧血基因型的檢測，與傳統(tǒng)創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷相比較，探討該方法的精確性和可行性。方法：針對廣西、廣東地區(qū)常見的β地中海貧血突變的基因型設(shè)計三對不同引物，并用生物素標記。對cffDNA進行二次PCR反應后，使用反向斑點雜交(revertdotblothybridization，RDB)檢測胎兒的β珠蛋白基因型，與創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較，觀看精確率。

結(jié)果：37例cffDNA標本檢測中，檢出重型β地中海貧血19例，輕型β地中海貧血11例，正常7例，與創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷結(jié)果相比較消失3例誤診，精確率為91.9%(34/37)。結(jié)論：利用cffDNA進行β地中海貧血的檢測，可能消失母源性DNA背景的污染，當胎兒基因型與母親基因型相同時，必需提高警惕，進一步分析或者復查。由于該技術(shù)取樣簡單，對孕婦胎兒無風險，不受孕期時間影響，易為與孕婦接受，因此進一步改良該技術(shù)后有望可用于β地中海貧血的診斷。第四部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行巴氏水腫胎兒檢測目的：通過檢測cffDNA以及母源性cfDNA在PCR反應中擴增效率的不同，進行檢測巴氏水腫胎兒(HbBart’shydropsfoetus)的方法學討論。方法：對來源于擬診孕水腫胎兒孕婦的小片段cffDNA，進行熒光PCR(FluorescencePCR)擴增，利用毛細管電泳(capillaryelectrophoresis，CE)技術(shù)推斷兩種產(chǎn)物峰面積比(peakarearatio)來檢測巴氏水腫胎兒。結(jié)果：30例擬診巴氏水腫胎兒的小片段