分子生物學(xué)-許曉東-0

分子生物學(xué)

——從一個表達(dá)系統(tǒng)說起西北農(nóng)林科技大學(xué)許曉東(2017.02)DNA雙螺旋模型的建立、密碼子的發(fā)現(xiàn)和解讀，使傳統(tǒng)生物學(xué)上差異巨大的動物、植物和微生物在分子水平上統(tǒng)一在了一起。這使生物學(xué)家有機(jī)會在一個物種中表達(dá)另一個物種的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在，我們試圖建立一個能表達(dá)外源基因的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)……中心法則我們需要宿主和載體Host:Escherichiacolivector:plasmid載體（vector）為什么需要一個載體？我們需要一個能在宿主內(nèi)存活的載體。

轉(zhuǎn)化現(xiàn)象質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒：是染色體外能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)形，然而目前也發(fā)現(xiàn)有少數(shù)的質(zhì)粒屬于線性構(gòu)形，它存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中。質(zhì)粒為什么能夠自主復(fù)制？

因?yàn)橘|(zhì)粒上有復(fù)制起始位點(diǎn)，是一個“復(fù)制子（replicon）”。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringentcontrol)和松弛控制型(Relaxedcontrol)?，F(xiàn)在需要一個位點(diǎn)用于插入外源基因片段——即多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsite,MCS）。MCS是包含多個限制性酶切位點(diǎn)（restrictionsite）的一段很短的DNA序列。把要表達(dá)的外源基因連接到質(zhì)粒上……這樣可以嗎？不行，我們需要啟動子和終止子。

啟動子（promotor）是一段能被RNA聚合酶所識別的序列。repliconForeigngenerepliconrepliconPlasmidpromoterterminator如何讓mRNA被翻譯機(jī)器識別？repliconForeigngenerepliconrepliconPlasmidpromoterE.colimRNAproteinXterminator需要核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosomebindingsite）ATG……………promoterRBSribosomebindingsiteAUG……………DNAmRNAprotein現(xiàn)在的問題是：如何使表達(dá)受控。TimeOD600promoterDNAmRNAproteinpromoter野生型大腸桿菌帶外源基因的大腸桿菌乳糖代謝酶基因的表達(dá)就是可控的——乳糖操縱子。初步構(gòu)建了載體還是有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)。表達(dá)水平不高。IPTG降低基礎(chǔ)表達(dá)：提高表達(dá)量：使用超強(qiáng)啟動子T7phageT7RNApolymerase最終的表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)LacI另一個解決方案BL21(DE3)LysSLines:marker(M),cellextractof

E.coliBL21(DE3)-pET22b(1);celllysateandextractof

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BL21(DE3)-pET22b-mocpA(2,3);of

E.coliBL21(DE3)-pET22b-mocpB(4,5);of

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BL21(DE3)-pET22b-mocpC(6,7);of

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