16S rDNA基因的PCR擴增課件

16SrDNA基因的PCR擴增16SrDNA基因的PCR擴增PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長16SrDNA基因的PCR擴增PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物16SrDNA基因的PCR擴增PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶16SrDNA基因的PCR擴增PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……16SrDNA基因的PCR擴增PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學獎16SrDNA基因的PCR擴增KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。16SrDNA基因的PCR擴增生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學檢測人類學研究……16SrDNA基因的PCR擴增基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段16SrDNA基因的PCR擴增94℃變性50-65℃退火XX℃延伸16SrDNA基因的PCR擴增94℃55℃37℃16SrDNA基因的PCR擴增TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402016SrDNA基因的PCR擴增72℃94℃55℃PCR循環(huán)16SrDNA基因的PCR擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點標準的PCR反應體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L16SrDNA基因的PCR擴增1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR反應條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍16SrDNA基因的PCR擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃16SrDNA基因的PCR擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物16SrDNA基因的PCR擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶16SrDNA基因的PCR擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點第1輪結(jié)束95℃第2輪開始16SrDNA基因的PCR擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq16SrDNA基因的PCR擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束16SrDNA基因的PCR擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增16SrDNA基因的PCR擴增我們實驗的反應體系10×Taq聚合酶反應緩沖液2.5μLdNTP(20mmol/L)2μL5’端引物（25pmol/μL）1μL3’端引物（25pmol/μL）1μL菌體DNA（約50ng/μL）1μLTaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μLH2O補足總體積25μL16SrDNA基因的PCR擴增反