第三節(jié)基因工程載體

第三節(jié)基因工程載體第1頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月本章重點掌握的內(nèi)容掌握載體、克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、α-互補、插入失活、人工染色體載體的概念?？寺≥d體DNA分子具備的條件。標(biāo)記基因的分類及其作用。pBR322、pUC18/19質(zhì)粒載體的組成、優(yōu)點及質(zhì)?？寺≥d體用途。λ-DNA載體的構(gòu)建、類型及其優(yōu)點。植物表達載體的組成、啟動子的類型等第2頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

遺傳物質(zhì)+載體

重組的DNA分子引入細胞或生物體內(nèi)復(fù)制與表達穩(wěn)定地遺傳給下代第3頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA：

1）獨立的一個包括啟動子（promoter)、編碼區(qū)（encodingregion)和終止子（terminator)的基因，or組成基因的某個元件，一般是不可以進入受體細胞的；

2）采用理化方法進入細胞后，也不容易在受體細胞內(nèi)維持。所以，通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。第4頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月載體（vector)是由在細胞中能夠自主復(fù)制的DNA分子構(gòu)成的一種遺傳成分；基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具稱為載體。目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細胞，并在其中維持高效表達，在很大程度上決定于載體。第三節(jié)基因工程載體第5頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件第6頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

載體的要求A、復(fù)制起點：能在受體中復(fù)制；B、篩選標(biāo)記；C、限制性內(nèi)切酶切割位點；D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；E、適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；F、載體的安全性：質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移;G、外源基因的表達：啟動子。第7頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322結(jié)構(gòu)圖

復(fù)制起點

遺傳標(biāo)記基因克隆位點克隆位點第8頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的分類按功能分類克隆載體克隆一個基因或DNA片斷表達載體用于一個基因的蛋白表達整合載體把一個基因插入到染色體組中按來源分類

質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體第9頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的種類和特征質(zhì)粒*受體細胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例

E.coli環(huán)狀＜

8kbpUC18/19,T-載體等

λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀＜

10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細胞線性染色體＞

1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒第10頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

克隆載體第11頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒載體1.質(zhì)粒的概念質(zhì)粒（plasmid)是一種存在于細菌或真菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,可自身復(fù)制和表達。

并不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）。

分子量在1-200kb之間。第12頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒載體大腸桿菌的質(zhì)粒第13頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體2.質(zhì)粒的空間構(gòu)型①共價閉合環(huán)狀DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）

第14頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體②

開環(huán)DNA（

opencircular，

ocDNA）一條鏈上有一至數(shù)個缺口。

③

線形DNA（

linear，LDNA）第15頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：

SCDNA最快、LDNA次之、OCDNA最慢。

SC

OC

L

第16頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體3.質(zhì)粒的基本特性

質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進行自主復(fù)制。質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系。根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型：嚴(yán)緊型（復(fù)制控制的）質(zhì)粒（stringentplasmid）

(拷貝數(shù)少，為1-5個)和松弛型（復(fù)制控制的）質(zhì)粒（relaxed）

(拷貝數(shù)多，可達10-200個拷貝)因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。質(zhì)粒

復(fù)制子

拷貝數(shù)

pBR322及其衍生質(zhì)粒

pMB115～20pUC系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒

突變的

pMB1500～700pSC101及其衍生質(zhì)粒pSC101～5ColE1ColE115～20第17頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性)

兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性。具有不相容性的質(zhì)粒組成的群體稱為不相容群，一般具有相同的復(fù)制子。

以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：

ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容

pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容

p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容

第18頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體攜帶特殊的遺傳標(biāo)記

野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：

物質(zhì)抗性

抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物

物質(zhì)合成

抗生素、細菌毒素、有機堿

這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第19頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體遺傳標(biāo)記基因

定義:在基因工程中使用與選擇重組體DNA轉(zhuǎn)化細胞的基因標(biāo)記基因的作用

1.指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞

2.指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子

第20頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體標(biāo)記基因的種類

1.抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因

2.營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，

這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。

3.生化標(biāo)記基因

其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ，GUS，CAT4.噬菌斑第21頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體第22頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)

第23頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

第24頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體pBR322重組克隆的篩選第25頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點：

第一，具有較小的分子量——4363bp。第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。

第三，具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后，每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。一、

質(zhì)粒載體第26頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC系列質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒載體（包括四個部分）：(i)來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點（ori）；(ii)氨芐青霉素抗性基因（ampr）；(iii)大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ’基因；(iv)位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，外源基因插入后破壞了lacZ’基因的功能。第27頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月10個連續(xù)的單一限制酶切位點，但它不破壞該基因功能。第28頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月α-互補：pUC類載體帶有l(wèi)acz’基因，編碼半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽），此片段與宿主細胞所編碼的羧基端半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補，形成有功能的半乳糖苷酶，稱α-互補。第30頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體第31頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體X-galX-gal-peptideC-terminusofb-galactosiase

+第32頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體互補顯色反應(yīng)

第33頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體α-互補(α-complementation)

第34頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體

pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點：具有較小的相對分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個細胞可達500-700個拷貝。適用于組織化學(xué)方法檢測重組體，有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用，在IPTG誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍色和白色菌落篩選重組體。具有MCS區(qū)段，便于外源基因的克隆。第35頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因

葡萄糖苷酸酶基因（GUS）

該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。

熒光素酶基因

熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細菌產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。

發(fā)光蛋白質(zhì)基因

發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍色。

第36頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體4.質(zhì)粒的命名原則人工組建的質(zhì)粒

人工組建的質(zhì)粒的第一個字母是質(zhì)粒英文名字（plasmid）的第一個字符p，用小寫。p后有2個字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和實驗室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號。如pBR322，字母p代表質(zhì)粒，BR是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名，322代表…構(gòu)建的一系質(zhì)粒的編號。第37頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

質(zhì)粒載體（3）穿梭質(zhì)粒載體(shuttlevector)：這種質(zhì)粒分子上含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細胞中復(fù)制并檢測，如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒、大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒等。第38頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體

噬菌體（Bacteriophage）它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA(線性)，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內(nèi)。第39頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體

噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：

1.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細胞；

2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增。第40頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(一)λ噬菌體的生物學(xué)特性

λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體；λ噬菌體由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成；λDNA在噬菌體中是線狀DNA分子，全長

48.502kb雙鏈DNA，60多個基因，其中有1/3的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據(jù)

。

cos位點（cohesiveendsite):在DNA兩端各有12nt的5`單鏈突出(5‘-GGGCGGCGACCT-3’)，彼此序列互補。它是包裝時的切割信號。第41頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(一)λ噬菌體的生物學(xué)特性λ噬菌體的生活周期第42頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體

λ噬菌體：雙鏈DNA溫和噬菌體DNA大小約為50kb粘性末端：12bp的互補單鏈

當(dāng)λ噬菌體進入寄主細胞內(nèi)后,其粘性末端能通過堿基互補作用,形成環(huán)狀DNA分子。粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點,它是包裝蛋白的識別位點,λ噬菌體的包裝與DNA特性和其它序列無關(guān),但對包裝的DNA大小有要求,包裝范圍大約在36kb-51kb。

第43頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體λ噬菌體作為構(gòu)建載體材料的依據(jù)：

λ噬菌體是一種溫和噬菌體；能承載比較大的外源DNA片段；在λ噬菌體分子上有許多限制性核酸酶識別位點，便于多種DNA酶切片段的克隆。第44頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(二)構(gòu)建λ噬菌體的基本原理

(1)λ噬菌體的缺陷：

基因組太大（48.5kb）；

酶切點太多，它有5個BamH1位點（G↓GATCC），6個BgⅠ位點（A↓GATCT），5個EcoRⅠ位點（G↓AATTC）。

野生型只能接納一定長度的DNA。若相當(dāng)于λ噬菌體的75-105%。

重組的λDNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細胞—利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。第45頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(三)構(gòu)建λ噬菌體的基本內(nèi)容

構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的基本策略：

切去部分非必須的區(qū)域；抹去多余的限制性內(nèi)切酶切割位點；插入可供選擇的標(biāo)記基因；建立體外包裝系統(tǒng)。第46頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體選擇標(biāo)記

(1)加裝選擇標(biāo)記imm434imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的λ-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，λ-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑。

第47頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體選擇標(biāo)記

(2)加裝選擇標(biāo)記lacZLacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物；而空載體λ-DNA則產(chǎn)生藍色透明斑。

第48頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(四)λ噬菌體載體的類型（1）插入型載體

只有1～2種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點

大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活

第49頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體（1）插入型載體

載體長度37kb插入位點體外包裝插入片段大小：0-14kb（51–37）插入片段體外包裝第50頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(四)λ噬菌體載體的類型（2）替換型載體

在其中央部位有一個可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆載體

。這是由于構(gòu)建此載體時，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點是反向重復(fù)序列，因此，當(dāng)外源DNA插入時，一對克隆位點之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。如：

λEMBL3第51頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第52頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體第53頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體插入型載體替換型載體第54頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(五)常用的λ噬菌體載體

（一）β－半乳糖苷失活插入型載體（二）免疫功能失活插入型載體（三）Charon系列取代型載體（四）λEMBL系列取代型載體（五）Spi-正選擇取代型載體（六）

λZAP插入型載體

第55頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月λDNA復(fù)制早期：一個ori，雙向復(fù)制晚期：滾環(huán)復(fù)制--多個λDNA分子形成線狀多聯(lián)體第56頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

頭部包裝蛋白首先結(jié)合在cos區(qū)的附近，形成包裝啟動復(fù)合物，A蛋白切割cos位點。包裝E第57頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(六)Lambda噬菌體載體的克隆原理及步驟

第58頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體(七)λ-DNA重組分子的體外包裝體外包裝原理：

λ噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開進行的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部和頭部蛋白所需的蛋白因子；尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體則只能形成頭部和尾部蛋白所需的蛋白因子。將這兩種突變型的噬菌體的提取物混合起來，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。第59頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第60頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體λ-DNA作為載體的優(yōu)點

λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡便λ-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因

第61頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體單純以噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體:裝載量大，能排斥空載體，轉(zhuǎn)染效率高,操作較難，DNA不穩(wěn)定。單純以質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體:有天然的抗性選擇標(biāo)記，操作容易（易于分離和轉(zhuǎn)化），較穩(wěn)定,裝載量小，轉(zhuǎn)化效率較低；第62頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體(一)柯斯質(zhì)粒載體

這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點、克隆位點、選擇性標(biāo)記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細胞內(nèi)。第63頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體柯斯質(zhì)粒載體的基本特點

具有λ噬菌體的特性(體外包裝，高效感染等)；具有質(zhì)粒載體的特性(易于克隆操作、選擇及高拷貝等)；具有較高容量（45kb）的克隆能力；具有與同源性序列的質(zhì)粒進行重組的能力。

不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞，在細胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒，因而不能形成噬菌斑。第64頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建第65頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體進行基因克隆的一般程序第66頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體柯斯質(zhì)粒載體的克隆原理及步驟

1．分離外源DNA片段35～45kb2．外源DNA與兩個粘粒相連，且cos方向相同

3．體外包裝：在的A蛋白的功能作用下切割cos位點并將其中的DNA包裝到成熟的噬菌體顆粒中去

4．感染E.coli：線狀的重組DNA被注入細胞并通過cos位點的環(huán)化，而形成粘粒載體，象質(zhì)粒一樣復(fù)制第67頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、人工染色體及其應(yīng)用

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，

此時考斯質(zhì)粒(45kb)和噬菌體的裝載量也遠遠不能滿足需要。

將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，

它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。

或稱為自主復(fù)制序列(ARS)第68頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、人工染色體及其應(yīng)用

人工染色體載體（artificialchromosomevector）:利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源DNA片段復(fù)制的載體。

實際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和復(fù)制起始位點的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點是能容納長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。

第69頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、人工染色體及其應(yīng)用

(一)酵母人工染色體

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。

YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。可以接受350-400kb的外源DNA片段。

四膜蟲的端粒序列

酵母染色體的復(fù)制子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記

大腸桿菌的復(fù)制子

大腸桿菌的選擇標(biāo)記第70頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、人工染色體及其應(yīng)用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用第71頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、人工染色體及其應(yīng)用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用pYAC3第72頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、人工染色體及其應(yīng)用

用pYAC3進行克隆策略如下：

載體用BamHI和SnaBI雙酶切，形成3個片段。

移去BamHI之間的片段，留下另外兩段，每一段的兩端都分別是TEL序列和SnaBI位點。

被克隆的DNA，兩端必須切成平末端(SnaBI是一個平末端內(nèi)切酶，識別TACGTA序列)。

把三者連接起來，形成了人工染色體。

用原生質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法把人工染色體轉(zhuǎn)入釀酒酵母。用作宿主的菌株是雙營養(yǎng)缺陷型Trp1-ura3-

，可以被人工染色體上的篩選標(biāo)記基因恢復(fù)成Trp1+ura3+

。

在基本培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，只有含有結(jié)構(gòu)正確的人工染色體的轉(zhuǎn)化體可以生存。

如果染色體構(gòu)建錯誤，如在被克隆的DNA兩側(cè)連接了相同的兩段載體DNA片段，則因缺少一種篩選標(biāo)記，使得轉(zhuǎn)化體不能在基本成分培養(yǎng)基上存活。

外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判斷，即可以很簡單地由菌落的顏色看出：紅色的菌落是重組體，而白色的菌落則不是。第73頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、人工染色體及其應(yīng)用(二)細菌人工染色體

細菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300kb之間。

pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)

構(gòu)建動植物基因文庫

缺點：會出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆DNA部分的缺失或重排。第74頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、人工染色體及其應(yīng)用(三)P1派生人工染色體

結(jié)合了

P1載體和

BAC載體的最佳特性，包括陽性選擇標(biāo)記

sacB及噬菌體

P1的質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子。

(四)哺乳動物人工染色體

第75頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

第二節(jié)

表達載體第76頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

表達載體克隆載體（cloningvector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復(fù)制子即可；表達載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強啟動子；穿梭載體（shuttlevector）：這類載體可以在原核細胞中復(fù)制，也可在真核細胞中擴增和表達。第77頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

表達載體第78頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

表達載體表達載體構(gòu)建的一般原則

1.閱讀框架與外源基因高效表達

2.啟動子與外源基因高效表達

3.轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達

4.有效的翻譯起始與外源基因高效表達

5.終止密碼子選擇與外源基因高效表達

6.外源蛋白的穩(wěn)定性與外源基因高效表達第79頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體真核基因在原核細胞中表達，載體必須具備的條件：⑴載體能夠獨立復(fù)制，具有復(fù)制起點。⑵應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應(yīng)具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進行轉(zhuǎn)錄。⑸應(yīng)具有很強的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。第80頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體大腸桿菌表達載體的基本成分第81頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體啟動子：影響表達效率的主要因素之一是啟動子的強弱。常見啟動子見下表。啟動子的強弱取決于啟動子本身的序列，尤其是—10和—35區(qū)的堿基組成及彼此的間隔長度，同時也與啟動子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始位點間的距離有很大關(guān)系。復(fù)制子：一段包含復(fù)制起始位點的DNA片段。Ecoli.質(zhì)粒常見的有pMB1、ColE1等。第82頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGT

PlLTTGACA

GATACT

PrecATTGATA

TATAAT啟動子第83頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體

最佳啟動子具備的條件：

第一必須是強啟動子第二啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平第三啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的（熱或化學(xué)誘導(dǎo)）第84頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達。終止子

強終止子的選擇與使用

目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用。第85頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體

外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）核糖體結(jié)合位點第86頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子

大腸桿菌絕大部分基因以

AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點第87頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。密碼子生物體對密碼子的偏愛性密碼子偏愛性對外源基因表達的影響

由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。構(gòu)建Ecoli.表達載體時要考慮所表達基因的種類和性質(zhì)，或?qū)ν庠椿虻膲A基進行適當(dāng)置換，或?qū)寺≥d體上的調(diào)控序列進行適當(dāng)調(diào)整。第88頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體第89頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體第90頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體第91頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體類型:

Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+終止子

Ⅱ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子

+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子

Ⅲ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)

+翻譯起始區(qū)

+信號肽鏈編碼區(qū)

+終止子（常稱之為表達分泌型載體）第92頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達載體

三種表達型載體結(jié)構(gòu)圖第93頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(一)原核表達載體

適用于在原核細胞中表達外源基因的載體

1.原核表達載體的表達元件

啟動子

轉(zhuǎn)錄終止子

核糖體結(jié)合位點（SD序列）

表達方式：

組成型表達

誘導(dǎo)型表達

融合型表達

分泌型表達

第94頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體

融合型表達載體

PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因(一)原核表達載體第95頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相載體

融合型表達載體

(一)原核表達載體第96頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(一)原核表達載體分泌型表達載體1、主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點：分泌表達，避免降解。

第97頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體

(二)酵母表達載體

原核生物和真核生物存在翻譯后修飾反應(yīng)機制的差異，

真核基因在原核表達系統(tǒng)中難以獲得有活性的蛋白。

酵母是真核表達的首選系統(tǒng)

酵母表達載體是一種穿梭表達載體：既能在大腸桿菌中繁殖，又能在酵母中復(fù)制、表達和選擇。

第98頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體

(二)酵母表達載體DNA復(fù)制起始區(qū)（含兩類復(fù)制起始序列）選擇標(biāo)記（營養(yǎng)缺陷型或顯性選擇標(biāo)記）有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達盒(啟動子、分泌信號序列、終止子等)第99頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體

(二)酵母表達載體第100頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(二)酵母表達載體第101頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(三)Ti質(zhì)粒表達載體

1.天然Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與及其致瘤功能

Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid)是根癌農(nóng)桿菌中可引發(fā)植物產(chǎn)生瘤狀物的質(zhì)粒，是環(huán)狀雙鏈DNA。

根據(jù)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的冠癭堿的不同可分為：

章魚堿型（octopine）胭脂堿型（nopaline）農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）[或稱琥珀堿型（succinamopine）]

其實這些Ti質(zhì)粒合成不同的冠癭堿外，在基因結(jié)構(gòu)上也有一定的差異第102頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體農(nóng)桿菌與植物細胞相互作用的機制第103頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體TiPlasmid：

已知農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細胞。第104頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(三)Ti質(zhì)粒表達載體

1.天然Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與及其致瘤功能

毒性區(qū)（vir區(qū)）：激活T-DNA的轉(zhuǎn)移

T-DNA區(qū)：侵染植物時，從Ti質(zhì)粒上被切割，轉(zhuǎn)移到植物細胞中，帶有與腫瘤形成有關(guān)的基因接合轉(zhuǎn)移區(qū)（Con區(qū)）：存在與細菌間進行接合有關(guān)的基因復(fù)制起始區(qū)（Ori區(qū)）：

保證Ti質(zhì)粒進行自我復(fù)制第105頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(三)Ti質(zhì)粒表達載體

2.Ti質(zhì)粒表達載體

利用T-DNA可攜帶DNA片段并整合到植物基因組的特性，對天然Ti質(zhì)粒進行改造，用于植物轉(zhuǎn)基因載體。

一元表達載體

雙元表達載體第106頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(三)Ti質(zhì)粒表達載體

2.Ti質(zhì)粒表達載體

一元表達載體【也稱為共整合載體（cointegratevectors）系統(tǒng)】

需要同源重組才能插入外源基因。

pGV3850是一種受體質(zhì)粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322質(zhì)粒作為中間載體。第107頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(三)Ti質(zhì)粒表達載體

2.Ti質(zhì)粒表達載體

一元表達載體外源基因插入pGV3850的過程第108頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體第109頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(三)Ti質(zhì)粒表達載體

2.Ti質(zhì)粒表達載體

雙元表達載體：由兩個分別含有T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的系統(tǒng)。

輔助Ti質(zhì)粒：含有Vir區(qū)，用于激活T-DNA的轉(zhuǎn)移

（由經(jīng)改靠的農(nóng)桿菌提供EHA105、LBA4404)

含

T-DNA的微型質(zhì)粒：是一種穿梭載體。

第110頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體第111頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體一元載體雙元載體（反式載體）第112頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達載體(四)動物質(zhì)粒表達載體第113頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院二、病毒表達載體

表達載體元件有：

源于病毒的啟動子和增強子；

病毒

的復(fù)制子序列以及所需的反式作用因子編碼基因；

polyA加尾信號

病毒載體可應(yīng)用于：

外源蛋白的真核表達

基因治療

多價、多聯(lián)活載體疫苗的研制

基因功能的鑒定第114頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院二、病毒表達載體(一)桿狀病毒表達載體

(二)腺病毒表達載體第115頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院二、病毒表達載體(三)反轉(zhuǎn)錄病毒載體(四)SV40病毒型轉(zhuǎn)化載體第116頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

特殊用途的載體（自學(xué)）第117頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院一、插入或定點整合突變載體(一)基因定點插入/基因敲除載體

(二)隨機插入突變載體

1.T-DNA插入突變載體

2.轉(zhuǎn)座子插入突變載體第118頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院二、啟動子探針型表達載體

特點：

具有一個無啟動子的易檢測的基因。這種基因必須滿足一個重要條件：基因編碼區(qū)