酶分子的化學修飾

酶分子的化學修飾第1頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的修飾共價修飾非共價修飾化學修飾遺傳修飾第2頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的化學修飾：在體外將酶分子通過人工方法與一些化學基團進行共價連接，從而改變酶的結構和性質。從廣義上說，凡通過化學基團的引入或除去，都可稱為酶的化學修飾。第3頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

意義：1.基礎酶學的研究；活性部位的研究一級結構的測定測定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。結構與功能的關系第4頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月2.提高生物活性；3.增強穩(wěn)定性；4.產(chǎn)生新的催化能力;5.解除免疫原性；第5頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)酶分子的修飾方法

一、酶的表面修飾酶分子表面的功能基：羧基、氨基、巰基、羥基、咪唑基等（一）小分子修飾：常用的小分子化合物主要：氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、鄰苯二酸酐、乙酸-N-丁二酯亞胺酯等第6頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月例：α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾一NHCH2COOH后，穩(wěn)定性在60℃可提高1000倍。馬肝醇脫氫酶的賴氨酸的乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力，同時酶穩(wěn)定性也提高許多，底物專一性也有所改變。第8頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）大分子修飾

可溶性大分子：如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、右旋糖苷、環(huán)糊精、肝素等。第9頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月例：PEG修飾的L-天冬酰胺酶免疫原性顯著降低、半衰期延長。天然過氧化氫酶在6h內很快從血液中被去，PEG修飾后，酶活力在血液循環(huán)中可保持72h右旋糖苷修飾α-淀粉酶：60℃,t1/2：3.5min；修飾后：175minMPEG修飾過氧化氫酶，三氯乙烷中酶活是原來的200倍。第11頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）交聯(lián)修飾使用雙功能或多功能試劑將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內不同肽鏈部分間進行共價交聯(lián)。（四）固定化修飾第12頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月例：枯草桿菌蛋白酶交聯(lián)酶晶體，其酶活提高13倍。葡聚糖二乙醛交聯(lián)青霉素G?；?，55℃下的半衰期提高9倍。絲氨酸氨白酶、胰蛋白酶通過交聯(lián)修飾，最適溫度從45℃提高到76℃。

第13頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月小分子修飾：穩(wěn)定性增加及一定催化特性的改變。大分子修飾：穩(wěn)定性增加；提高在非水相中的催化能力；免疫原性與抗原性降低、延長半衰期。交聯(lián)修飾：提高其穩(wěn)定性，增加酶在非水溶液中的使用價值。

第14頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酶分子的內部修飾（一）催化活性基團的修飾產(chǎn)生新的催化能力硫代烷基化反應，枯草桿菌蛋白酶活性部位的Ser轉化為半胱氨酸，對肽或酯無水解能力，但能水解硝基苯酯?；瘜W突變：將一種氨基酸側鏈化學轉化為另一種新的氨基酸側鏈的方法。第15頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）非催化活性基團的修飾改變酶的動力學特征、影響酶的專一性。胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亞砜，該酶對含芳香族或大體積脂肪族的專一性底物的Km提高2-3倍。第16頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）

蛋白質主鏈的修飾依靠酶法，水解部分酶片斷。天冬氨酸酶有限水解切去10個氨基酸后，酶活提高5.5倍第17頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

（四）

與輔因子相關的修飾

1．依賴輔助因子的酶①

輔因子共價結合在酶上；

NADH共價結合到醇脫氫酶，活力為原來的40%,但解決了輔因子循環(huán)利用的問題。

第18頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月②引入新的輔因子或對輔助因子進行修飾。例：黃素共價結合在木瓜蛋白酶上，從而將蛋白酶轉變成氧化原酶。

修飾輔助因子，可創(chuàng)造出多種多樣的新酶。第19頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月2.金屬酶中的金屬取代酶分子中的金屬取代可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。例：酰化氨基酸水解酶活性部位中的鋅被鈷取代后，酶的底物專一性和最適pH都有改變。第20頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

酶蛋白側鏈的小分子修飾

一、巰基的化學修飾烷基化試劑：有鹵代乙酸、芳香鹵、芳香族磺酸。常用的有碘代乙酸和碘乙酰胺、巰基乙醇。有機汞試劑：對氯汞苯甲酸(pCMB)專一性最強，修飾產(chǎn)物在250nm處有最大吸收。

第21頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月5，5’-二硫代-雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）(Ellman試劑)，反應生成的陰離子在412nm處有最大吸收。定量酶分子中巰基數(shù)目最常用的試劑。N-乙基馬來酰亞胺(NEM)：反應專一性很強的疏基修飾劑，反應產(chǎn)物在300nm處有最大吸收。第22頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月二、氨基的化學修飾烷基化試劑：

碘代乙酸

三硝基苯磺酸（TNBS）：與賴氨酸殘基反應，420nm，367nm能產(chǎn)生特定的光吸收。磷酸毗哆醛(PLP)是一種非常專一的賴氨酸修飾試劑，反應可通過325nm處光吸收定量。第23頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月2,4-二硝基氟苯（DNFB）法(又稱sanger試劑)；丹磺酞氯(DNS)法；苯異硫氰酸酯(PITC)法。用于多肽鏈N-末端殘基的測定的化學修飾方法。第24頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、羧基的化學修飾水溶性的碳二亞胺類特定修飾酶的羧基已成為最普通的標準方法，在一定條件下，絲氨酸、半胱氨酸和酪氨酸也可以反應。第25頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月四、咪唑基的化學修飾焦碳酸二乙酯(DPC)和碘代乙酸。DPC對組氨酸殘基有較好的專一性，產(chǎn)物在240nm處有最大吸收，可跟蹤反應和定量。DPC還可能修飾巰基，用連四硫酸鈉或連四硫酸鉀對巰基進行可逆地保護。第26頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月五、吲哚基的化學修飾N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)：產(chǎn)物可通過280nm處光吸收的減少跟蹤反應。2-羥基-5-硝基芐溴(HNBB)和4-硝基苯硫氯對吲哚基修飾比較專一。但易與巰基作用，修飾時應對巰基進行保護。第27頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

六、二硫鍵的化學修飾二硫蘇糖醇（DTT）巰基乙醇第28頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

七、酚基的化學修飾四硝基甲烷（TNM）：最常用的具高度專一性酪氨酸殘基的修飾劑。蘇氨酸和絲氨酸殘基：一般都可被修飾酚羥基的修飾試劑所修飾；二異丙基氟磷酸（DFP）對絲氨酸有高度反應性。第29頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

八、胍基的化學修飾常用丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛。4-羥基-3-硝基苯乙二醛（405nm）對硝基苯乙二醛（340nm）具有光吸收性質，并且產(chǎn)物具有旋光性，特別適合于精氨酸的定量。第30頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月化學修飾反應的類型

1)烷基化反應試劑特點：烷基上帶活潑鹵素，導致酶分子的親核基團（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化。可作用基團：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。

第31頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月烷基化反應第32頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

2)?；磻噭┨攸c：含有結構，作用于側鏈基團上的親核基團，使之?；?。可作用基團：

氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）第33頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

?；磻?/p>

第34頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

3)氧化和還原反應試劑特點：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2可被氧化的側鏈基團:巰基，甲硫基，等。還原劑：2－巰基乙醇、DTT等。可被還原的側鏈基團：二硫鍵。第35頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸側鏈基團修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺

各種氨基酸側鏈的修飾劑第36頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

酶蛋白側鏈的大分子修飾

常用修飾劑：聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、環(huán)糊精、蔗糖聚合物(Ficoll)、肝素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、等?；罨盒揎梽┑幕罨粗苽湫揎梽┭苌?。偶聯(lián)：與酶蛋白偶聯(lián)反應。第37頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月proteinHalflifeinvivo(h)Injections/weekα-IFNβ-IFNHGHEPOG-CSFGM-CSF5.60.60.3652337377各類蛋白類藥物的體內半衰期及注射次數(shù)第38頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月IFN-α2aand40kDa(PEG)–IFN-α2a的藥代動力學

第39頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月酶

半衰期相對穩(wěn)定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD35h350蛋白類藥物修飾后的半衰期及穩(wěn)定性第40頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1.PEG（PolyethyleneGlycol）簡介：①

具有兩親性;②

無毒，免疫原性低;③

分子量范圍很寬，從幾百到數(shù)十萬，選擇余地大;修飾劑一般為500～20000④

可以將它的許多優(yōu)良性質:如親水性，柔性、抗凝血性、抗巨噬細吞噬性等，賦予修飾后的生物分子。H(-O-CH-CH)n-OH第41頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月為避免在修飾過程中發(fā)生交聯(lián)和團聚，通常采用單甲氧基聚聚乙二醇(mPEG)作為修飾劑。CH3(-O-CH-CH)n-OH第42頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月2.PEG的活化1)三氯均嗪法MPEG1

MPEG2

均三嗪，三聚氯氰第44頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月消化酶作用下的過氧化氫酶的活性保留第45頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月2).N-羥基琥珀酰亞胺法第46頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第一代PEG衍生物：反應選擇性低；修飾后蛋白藥物的抗原性和半衰期改進效果不明顯；容易引發(fā)蛋白質的交聯(lián)與團聚；衍生物與藥物反應形成的連接鍵穩(wěn)定性不高。第48頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1.N-末端氨基修飾PEG-醛蛋白質N端α氨基的pKa為7.6~8.0，而分子內賴氨酸的ε-氨基的pKa為10.0~10.2mPEG-醛與N端氨基的偶聯(lián)第二代PEG衍生物第49頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月2.疏基修飾①PEG-馬來酰亞胺②PEG-吡啶-二硫醚；③PEG-乙烯基砜④PEG-碘乙酰胺。第50頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月3.羧基端的修飾mPEG-酰肼或mPEG-胺mPEG-酰肼與羧基的偶聯(lián)第51頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月枝形PEG單鏈叉形PEG多鏈叉形PEG第52頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)品號末端基團分子量包裝（g）價格（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羥基琥珀酰亞胺5K1