抗體的表達(dá)原理培訓(xùn)課件

提要

基因工程抗體巴在多種體系獲得成功表達(dá)，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、大腸桿茵、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物以及轉(zhuǎn)基出動(dòng)物等表達(dá)體系。其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞最接近抗體產(chǎn)生的天然宿主，是比較成熟、應(yīng)用最多的表達(dá)體系，主要用于表達(dá)完整抗體分子，目前治療性單抗的生產(chǎn)基本都用這一表達(dá)體系。通過對(duì)友達(dá)載體、宿主細(xì)胞及各環(huán)節(jié)的改良和完善，己可達(dá)到100mg／L左右的表達(dá)水平，大腸桿菌體系不能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化，只能表達(dá)抗體分子片段，但由于其遺傳背景清楚，操作簡單，成本低，周期短等優(yōu)點(diǎn)，亦有較廣泛的應(yīng)用，尤其在研究領(lǐng)域。1抗體的表達(dá)原理7/20/2023

酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系具有一定的糖基化功能，能表達(dá)完整抗體分子，可達(dá)到較高表達(dá)量，其操作及成本較哺乳動(dòng)物細(xì)腦有一定優(yōu)勢，但在抗體表達(dá)中的應(yīng)用尚不多，應(yīng)用價(jià)值有待評(píng)價(jià)。轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)體系主要用于工程抗體的大規(guī)模生產(chǎn)，其成功應(yīng)用尚需時(shí)日。2抗體的表達(dá)原理7/20/2023抗體載體體統(tǒng)的種類1哺乳動(dòng)物表達(dá)載體系統(tǒng)2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)3酵母及昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)4動(dòng)植物表達(dá)系統(tǒng)3抗體的表達(dá)原理7/20/2023第一節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞是最早用來表達(dá)抗體分子的，也是目前應(yīng)用最多的表達(dá)體系。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有抗體折疊形成正確立體空間構(gòu)象所必需的分子伴侶，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為抗體分子的正確折疊和鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵的形成提供了有利的氧化-還原環(huán)境。4抗體的表達(dá)原理7/20/2023此外哺乳類動(dòng)物細(xì)胞還擁有完整的轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工及分泌等機(jī)制，包括抗體的糖基化、羧基化等一系列復(fù)雜的加工過程，因而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗體通常具有正確的折疊和空間構(gòu)象以及正確的裝配，具有良好生物活性，基本近似于天然抗體。5抗體的表達(dá)原理7/20/2023

同時(shí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞還能實(shí)現(xiàn)抗體的分泌性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可分泌至無血清或無蛋白的培養(yǎng)上清中，為抗體的分離純化提供了最大的便利。此外表達(dá)抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞也能進(jìn)行規(guī)模化培養(yǎng)，為抗體的產(chǎn)業(yè)化相應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。6抗體的表達(dá)原理7/20/2023哺乳動(dòng)物表達(dá)細(xì)胞

但哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系存在構(gòu)建周期長、操作煩瑣，表達(dá)產(chǎn)量相對(duì)低，生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)。因此、盡管哺乳功物細(xì)胞表達(dá)體系能用于各種基因工程抗體的表達(dá)．但最適合表達(dá)的還是全分子抗體．以及某些不適宜在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的小分子抗體。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系包括宿主細(xì)胞和表達(dá)載體：目前常用的宿主細(xì)胞主要有兩類，一類是淋巴類細(xì)胞，另一類是非淋巴類細(xì)胞。7抗體的表達(dá)原理7/20/2023一、淋巴類細(xì)胞

在體內(nèi)抗體是由漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，漿細(xì)胞具有抗體正確折疊，空間構(gòu)象形成，鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵形成的內(nèi)環(huán)境，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及參與此過程的各種協(xié)向因子和分子伴侶(加重鏈結(jié)合蛋白BiPGRP78，二硫化異構(gòu)酶等等)，而且還合完成抗體恒定區(qū)糖基化等翻譯后加工修飾的細(xì)胞器、蛋白及代謝產(chǎn)物；因此漿細(xì)胞應(yīng)是最適合表達(dá)重組抗體的。但漿細(xì)胞不能在體外長期培養(yǎng)，永生化或惡性轉(zhuǎn)化的漿細(xì)胞瘤和骨髓瘤細(xì)胞系對(duì)于表達(dá)重組抗體是最接近漿細(xì)胞的，這些細(xì)胞同漿細(xì)胞一樣能提供抗體表達(dá)所需的全套協(xié)同因子、分子伴侶以及糖基化等加工機(jī)制。8抗體的表達(dá)原理7/20/2023

因此能用于表達(dá)各種重組的基因工程抗體。但是有的骨髓瘤細(xì)胞系本身也產(chǎn)生免疫球蛋白鏈，大多為κ輕鏈，選擇時(shí)應(yīng)首先考慮用那些本身不產(chǎn)生免疫球蛋白肽鏈的骨髓瘤細(xì)胞系。由于目前尚無穩(wěn)定但自身不分泌Ig的人骨髓瘤細(xì)胞系，因此，用于表達(dá)基因工程抗體的淋巴類細(xì)胞，主要是小鼠和大鼠的骨髓瘤細(xì)胞。9抗體的表達(dá)原理7/20/2023

目前在表達(dá)基因工程抗體最多的骨髓瘤細(xì)胞是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0和NSO，以及大鼠的骨髓瘤細(xì)胞YB2/0。這些骨髓瘤細(xì)胞均不產(chǎn)生和分泌任何免疫球蛋白。SP2/0細(xì)胞系是小鼠骨髓細(xì)胞p3—x63—Ag8與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞融合而成的雜交瘤，再經(jīng)培養(yǎng)和藥物篩選發(fā)生變異后獲得的細(xì)胞系。SP2/0是在表達(dá)基因工程抗體中用得最廣泛的淋巴類細(xì)胞，尤其在人—鼠嵌合抗體的表達(dá)中用得最多，僅其表達(dá)產(chǎn)量通常較低，多用于實(shí)驗(yàn)研究。10抗體的表達(dá)原理7/20/2023NSO細(xì)胞系是能在胞內(nèi)合成κ輕鏈的NS—1細(xì)胞的變異株，不再產(chǎn)生任何免疫球蛋白鏈，能用于表達(dá)各種全分子抗體，用該細(xì)胞系表達(dá)的抗人EGF受體的人源化改型抗體己在三期臨床試用中。此外，也有用小鼠骨髓瘤P3UI細(xì)胞表達(dá)人—鼠嵌合抗體。用于表達(dá)重組抗體的大鼠骨髓瘤細(xì)胞僅見有YB2/0細(xì)胞的報(bào)道，該細(xì)胞系是大鼠骨髓瘤細(xì)胞Y3與A0株大鼠脾細(xì)胞融合建立的，本身也不表達(dá)任何免疫球蛋白肽鏈。用骨髓瘤表達(dá)重組抗體時(shí)，所用的表達(dá)載體通常多選用免疫球蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，因這些細(xì)胞中含有它們所需要的轉(zhuǎn)錄因子，有利抗體的高表達(dá)。11抗體的表達(dá)原理7/20/2023二、非淋巴類細(xì)胞

多種非淋巴類細(xì)胞都已被用于表達(dá)重組抗體，其中包括中國倉鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)細(xì)胞、猴腎來源的COS細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、嗜傷細(xì)胞、Hela細(xì)胞、BHK細(xì)胞等等．這些不同組織來源的不同類型的細(xì)胞，在蛋白質(zhì)的糖基化中可能會(huì)有所差別，但到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)從這些非淋巴類細(xì)胞中表達(dá)的重組抗體有功能性的缺陷。非淋巴類細(xì)胞在表達(dá)重組抗體時(shí)若使用免疫球蛋自自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，其表達(dá)效率低、出此常采用其他較強(qiáng)的啟動(dòng)子，如SV40早期基因和晚期基因啟動(dòng)子(Psv40-EL),12抗體的表達(dá)原理7/20/2023CHO

人巨細(xì)胞病毒立早基因啟動(dòng)子(PhCMV-IE)，病毒長末端重復(fù)序列LTR等等。通常非淋巴細(xì)胞表達(dá)重組抗體的產(chǎn)量低于淋巴類細(xì)胞，大多數(shù)在lug／ml以下。但近十余年的研究表明，通過一系列現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是高效擴(kuò)增表達(dá)技術(shù)，可使重組抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)量達(dá)200ug/ml。13抗體的表達(dá)原理7/20/2023

此外，CHO細(xì)胞遺傳背景清楚；轉(zhuǎn)染效率高；能適用于多種載體；能表達(dá)各種類型的重組抗體；可長期穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定表達(dá)有功能活性抗體；可用無血清或無蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)，有利于抗體的純化；能進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。因而CHO細(xì)胞已成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)的首選工程細(xì)胞系，目前已批準(zhǔn)上市的基因工程抗體幾乎都是在CHO細(xì)胞中表達(dá)的。14抗體的表達(dá)原理7/20/2023COS

另一種常用于表達(dá)重組抗體的非淋巴類細(xì)胞是COS細(xì)胞，COS細(xì)胞是用sv40病毒的大T抗原轉(zhuǎn)染猴腎細(xì)胞獲得的一株能長期傳代的細(xì)胞系，含有SV40復(fù)制子的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞后，其重組DNA并不整合到細(xì)胞的染色體上、而是以游離的形式存在于細(xì)胞漿內(nèi)、并迅速大量復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)；COS細(xì)胞也具有糖基化和裝P配分泌抗體的功能。15抗體的表達(dá)原理7/20/2023

因此表達(dá)的各種抗體具有抗體的功能活性：由于轉(zhuǎn)染的外源DNA在COS細(xì)胞并不整合，而是以游離形式存在并復(fù)制，因此COS細(xì)胞最常用于抗體的瞬時(shí)表達(dá)。近年來COS細(xì)胞己用于篩選或檢測新構(gòu)建的新型抗體的活性及特征，也用于研究從噬菌體庫中篩選的抗體基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的功能和特點(diǎn)，還用于各種抗體突變體的篩選。而且，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的雙特異性抗體也在COS細(xì)胞表達(dá)成功。如抗人OKT3/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的雙特異抗體在COS細(xì)胞成功表達(dá)，其產(chǎn)量和活性均優(yōu)于在大腸桿菌中的表達(dá)。16抗體的表達(dá)原理7/20/2023

三、抗體的高效表達(dá)

治療用基因工程抗體的臨床用藥量大，還遠(yuǎn)超過其它生物制品。以美國批準(zhǔn)上市的治療腫瘤的兩種人源化抗體Rituxan和Herceptin為例，Rituxan一個(gè)療程約需用藥1.2g，Herceptin一個(gè)療程約需用藥0.88g，而正在臨床試用的抗VEGF人源化抗體，一個(gè)病人的最大用藥量甚至達(dá)到了7.8g，這些抗體類生物制品比細(xì)胞因子類生物制品用藥量高出幾萬倍。因而基因工程抗體的高效表達(dá)已經(jīng)成為其臨床應(yīng)用的最重要的先決條件之一，甚至已影響到基因工程抗體的研究開發(fā)。目前已上市的以及正處于臨床試用中的基因工程抗體多達(dá)上百種，其中絕大多數(shù)那是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的，更確切地說，是在CHO細(xì)胞中表達(dá)的。以下將簡要地?cái)⑹隹贵w在哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)所涉及的諸多要素(見表7-1)。17抗體的表達(dá)原理7/20/202318抗體的表達(dá)原理7/20/2023抗體表達(dá)的策略

抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的過程是抗體的重組表達(dá)載體與宿主細(xì)胞之間相互作用的一個(gè)復(fù)雜過程，包括5個(gè)相對(duì)獨(dú)立的環(huán)節(jié)：①抗體基因在宿主細(xì)胞染色體上的定位，主要是指抗體基因在染色體上的整合位點(diǎn)以及抗體基因的基因劑量。②抗體mRNA的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素。③抗體基因的翻譯。④抗體的翻譯后加工、組裝。⑤抗體的分泌；針對(duì)以上5個(gè)環(huán)節(jié)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的措施提高各環(huán)節(jié)的效率，有助于提高基因工程抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平。此外還有一些實(shí)際操作因素的影響，如高表達(dá)細(xì)胞株的篩選，生產(chǎn)細(xì)胞的穩(wěn)定等等。19抗體的表達(dá)原理7/20/2023（一）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)

基因工程抗體的表達(dá)載體系統(tǒng)是獲得高表達(dá)抗體細(xì)胞株的關(guān)鍵，在確定宿主細(xì)胞后，基因工程抗體的表達(dá)產(chǎn)量很大程度上由共表達(dá)載體的各表達(dá)調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定。一般來說，表達(dá)載體含有以下幾種基本元件：骨架序列、選擇標(biāo)志基因、表達(dá)盒以及一些特殊的調(diào)控序列。除骨架序列外，其它元件對(duì)抗體的高效表達(dá)均存在一定的影響。20抗體的表達(dá)原理7/20/2023載體系統(tǒng)分類根據(jù)工程細(xì)胞克隆中目的基因拷貝數(shù)能否擴(kuò)增，表達(dá)載體可分為兩類：A可擴(kuò)增表達(dá)載體系統(tǒng)。B不可擴(kuò)增表達(dá)的載體系統(tǒng)。有一類特殊的選擇標(biāo)志基因可以在外界逐漸增高的選擇壓力下實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞染色體上的基因拷貝數(shù)的擴(kuò)增，并且可以連帶兩側(cè)的序列一同擴(kuò)增，從而提高產(chǎn)量。21抗體的表達(dá)原理7/20/2023二氫葉酸還原酶(DHFR)

目前報(bào)道的基因工程抗體的高效表達(dá)載體系統(tǒng)無一例外地采用了可擴(kuò)增表達(dá)的載體。上述的可擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因目前主要包括有二氫葉酸還原酶(dhfr)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因，其中使用最久、最廣泛、效果最好的dhfr基因。

dhfr基因編碼的DHFR是細(xì)胞代謝途徑中的一個(gè)重要的酶．當(dāng)細(xì)胞缺乏此酶或此酶失活時(shí)必須依靠在培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核核苷才能存活。22抗體的表達(dá)原理7/20/2023

甲氨蝶呤(MTX)是DHFR的類似底物．可競爭抑制DHFR的活性。當(dāng)環(huán)境存在高濃度的MTX，dhfr基因可自發(fā)在染色體上擴(kuò)增共拷貝數(shù)，以產(chǎn)生更多的DHFR來維持細(xì)胞的正常代謝，當(dāng)其擴(kuò)增時(shí)，可以連帶它兩側(cè)的序列一起擴(kuò)增，dhfr基因共擴(kuò)增的序列的大小通常比該基因要大許多，甚至可以達(dá)到上千個(gè)kb，足以包含其兩翼的目的抗體基因，這種共擴(kuò)增也就實(shí)現(xiàn)了目的抗體基因的基因劑量的擴(kuò)增，從而極大地提高表達(dá)產(chǎn)量。23抗體的表達(dá)原理7/20/2023

dhfr基因在CHO細(xì)胞中擴(kuò)增時(shí)能在染色體上形成較穩(wěn)定的多拷貝序列，存在于宿主細(xì)胞染色體中。因此選擇可擴(kuò)增表達(dá)系統(tǒng)時(shí)最好選擇在CHO細(xì)胞中表達(dá)，另外．內(nèi)源性dhfr基因的存在會(huì)降低外源性dhfr基因帶動(dòng)擴(kuò)增目的基因的效果。因此應(yīng)該選擇dhfr基因缺陷的CHO-dhfr

-細(xì)胞，以達(dá)到抗體的最高表達(dá)。24抗體的表達(dá)原理7/20/2023谷氨酰胺合成酶(GS)

利用GS基因也可對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增；GS基因是一種顯性基因擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因，在染色體上可以有較高的擴(kuò)增倍數(shù)，像dhfr基因一樣，擴(kuò)增時(shí)連帶兩側(cè)序列一起擴(kuò)增。在外界存在蛋氨酸磺酰胺(MSX)時(shí)。不表達(dá)或弱表達(dá)GS基因的細(xì)胞受到MSX的顯性篩選死亡，而GS基因表達(dá)較高的細(xì)胞則能存活。細(xì)胞對(duì)MSX的耐受濃度與GS基因的表達(dá)水平呈劑量依賴關(guān)系，提高M(jìn)SX的濃度將要求細(xì)胞有更高水平的基因表達(dá)．造成GS基因和目的基因的擴(kuò)增，達(dá)到目的基因的高表達(dá)。25抗體的表達(dá)原理7/20/2023表達(dá)載體的表達(dá)盒

每一個(gè)表達(dá)載體均帶有目的基因的表達(dá)盒，表達(dá)盒一般包括啟動(dòng)子、克隆位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。因?yàn)榭贵w分泌前導(dǎo)肽通常適用于多種抗體基因，所以還可以將抗體分泌前導(dǎo)肽也包含在表達(dá)盒中。另外，還可以在抗體分泌前導(dǎo)肽前再加上一些特殊的表達(dá)調(diào)控序列。抗體基因表達(dá)盒的組織形式己較為固定，但其中各元件的選擇仍然有值得探討的地方。26抗體的表達(dá)原理7/20/20231啟動(dòng)子

抗體基因表達(dá)盒中最關(guān)鍵的元件是驅(qū)動(dòng)抗體基因表達(dá)的啟動(dòng)子以及相應(yīng)的增強(qiáng)子。所有的真核啟動(dòng)子都含有兩個(gè)基本組成部分，TATA盒和其下游的富含GC的序列，TATA盒確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，富含GC的序列則決定轉(zhuǎn)錄起始頻率，因而不同的啟動(dòng)子產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄起始頻率。目前使用的哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)于主要有病毒啟動(dòng)子，如SV40早期基因和晚期基因的啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒立早基因啟動(dòng)子、病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)等；哺乳類動(dòng)物細(xì)胞基因的啟動(dòng)子，如轉(zhuǎn)錄因于EF-1α的啟動(dòng)子、人干擾素-α的啟動(dòng)子、各種鼠IgG啟動(dòng)子等。27抗體的表達(dá)原理7/20/20232核糖體進(jìn)入位點(diǎn)

啟動(dòng)子下游有真核的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，它對(duì)于所有的抗體基因的表達(dá)都是必要的。真核的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)通常為GCCGCCA/GCCAUGG+4的共有序列，它通過調(diào)控核糖體進(jìn)入mRNA起始翻譯的頻率來影響目的基因的翻譯效率，從而影響目的基因的表達(dá)水平。通常載體均帶有核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，但其起始翻譯的效率并不太高。前面提到的IRES具有較強(qiáng)的起始翻譯的能力。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)在某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因前，存在某些類似IRES的序列、可以獨(dú)立啟動(dòng)翻譯，并且產(chǎn)生的翻譯效率很高，可以稱之為翻譯型增強(qiáng)子。28抗體的表達(dá)原理7/20/20233轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和polyA加尾信號(hào)

載體的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多聚腺苷酸(PolyA)加尾信號(hào)也在很大程度上影響抗體基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄的終止和polyA尾巴的合成影響mRNA的有效合成和穩(wěn)定性。強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和加尾信號(hào)可提高胞漿中能進(jìn)行有效翻譯的mRNA濃度，提高表達(dá)水平。目前使用最廣泛的是牛生長激素的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和加尾信號(hào)(BGHpolyAsite)，它的轉(zhuǎn)錄終止作用強(qiáng)于SV40的。雖然它也能有效地終止轉(zhuǎn)錄，并在以前被廣泛采用，但最近的高效表達(dá)載體已極少采用。另外的此轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和加尾信號(hào)也有被采用的，如人β-actin的polyA和抗體本身的polyAsite，均獲得滿意的效果。另外，將兩個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和加尾信號(hào)串聯(lián)使用也可能增強(qiáng)終止轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度，例如同時(shí)利用抗體恒定區(qū)基出組序列的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和加尾信號(hào)以從載體上具有的BGHpolyA信號(hào)。29抗體的表達(dá)原理7/20/2023(二)抗體高效表達(dá)的其他因素1抗體基因的結(jié)構(gòu)2抗體表達(dá)克隆的篩選3宿主細(xì)胞的選擇和篩選30抗體的表達(dá)原理7/20/202331抗體的表達(dá)原理7/20/2023有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)32抗體的表達(dá)原理7/20/202333抗體的表達(dá)原理7/20/2023

34抗體的表達(dá)原理7/20/202335抗體的表達(dá)原理7/20/2023invitrogen36抗體的表達(dá)原理7/20/2023Qiagene37抗體的表達(dá)原理7/20/2023第二節(jié)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是應(yīng)用最廣的源和表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)量高，成本低，周期短等特點(diǎn)。以下簡述原核表達(dá)載體的構(gòu)成元件及特點(diǎn)38抗體的表達(dá)原理7/20/2023表達(dá)策略39抗體的表達(dá)原理7/20/2023一、基因表達(dá)信號(hào)

如果將外源基因插入標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體，不可能合成重組蛋白，因?yàn)榛虻谋磉_(dá)依賴于基因周圍的一組信號(hào)，這些信號(hào)必須能被細(xì)菌識(shí)別。這些信號(hào)都是一些短的核苷酸序列，為轉(zhuǎn)錄和翻譯提供信號(hào)，三個(gè)最重要的信號(hào)：

1）promoter:是轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，在E.coli中，啟動(dòng)子必須能被RNA聚合酶的sigma亞基所識(shí)別。

2）Terminator：轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點(diǎn)，終止子一般是可以自我配對(duì)形成stem-loop的核苷酸序列。

3）核糖體結(jié)合位點(diǎn)：能被核糖體識(shí)別的位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄成mRNA分子后，核糖體在這一位點(diǎn)上結(jié)合。

高等生物的基因也被表達(dá)信號(hào)所包圍，但他們的核苷酸序列與E.coli的并不相同。比較E.coli和人類的啟動(dòng)子，有一些是相同的，但是E.coli的RNA聚合酶不可能結(jié)合到人類的啟動(dòng)子上，細(xì)菌不能識(shí)別人類基因的表達(dá)信號(hào)。

40抗體的表達(dá)原理7/20/2023

解決的方法是將外源基因插入載體中，使其處于一系列的E.coli表達(dá)信號(hào)的控制之下。這樣基因可以轉(zhuǎn)錄和表達(dá)?？寺≥d體提供了表達(dá)的信號(hào)，所以可以用來生產(chǎn)重組蛋白，被稱為表達(dá)載體。

（一）啟動(dòng)子

啟動(dòng)子是表達(dá)載體的最重要的組成成分，這是因?yàn)閱?dòng)子控制了基因表達(dá)的第一個(gè)階段，決定了mRNA合成的速度。獲得重組蛋白的數(shù)量很大程度上取決于表達(dá)載體所攜帶的啟動(dòng)子。

41抗體的表達(dá)原理7/20/2023

所有E.coli啟動(dòng)子都有兩個(gè)保守序列，保守序列的變化是影響轉(zhuǎn)錄效率的主要因素。強(qiáng)啟動(dòng)子可以啟動(dòng)高效率的表達(dá)，合成大量表達(dá)產(chǎn)物。相反，弱啟動(dòng)子，在細(xì)胞中表達(dá)量較低。表達(dá)載體應(yīng)該含有強(qiáng)啟動(dòng)子，這樣克隆的基因可以以最高的速度表達(dá)。

建立表達(dá)載體的另一個(gè)需要考慮的因素是啟動(dòng)子的調(diào)控，主要有兩種調(diào)控方式：

誘導(dǎo)：一個(gè)誘導(dǎo)的基因是在加入底物后基因的表達(dá)才能啟動(dòng)

抑制：可抑制的基因是在加入調(diào)控物后表達(dá)被關(guān)閉。a)啟動(dòng)子的選擇42抗體的表達(dá)原理7/20/2023真核原核啟動(dòng)子差異43抗體的表達(dá)原理7/20/2023

基因調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，啟動(dòng)子的參與僅僅是間接的。許多參與誘導(dǎo)和抑制的序列存在于啟動(dòng)子的周圍。所以誘導(dǎo)和抑制啟動(dòng)子的化學(xué)試劑也同樣調(diào)控克隆基因的表達(dá)。

如果重組蛋白對(duì)細(xì)菌有害，其合成必須嚴(yán)格控制在毒性的水平之下?？梢岳谜{(diào)控物抑制基因的表達(dá)。即使重組蛋白對(duì)寄主細(xì)胞無害，仍然需要調(diào)控克隆基因的表達(dá)，因?yàn)槌掷m(xù)的高水平表達(dá)可以影響重組質(zhì)粒的復(fù)制，最終導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的下降。44抗體的表達(dá)原理7/20/2023b)表達(dá)載體應(yīng)用的啟動(dòng)子

幾種使用頻率最高的啟動(dòng)子：

1)lac啟動(dòng)子：控制編碼β-乳糖苷酶的lacZ基因轉(zhuǎn)錄的序列，可以被IPTG所誘導(dǎo)，所以加入誘導(dǎo)物后，可以誘導(dǎo)啟動(dòng)子下游的外源基因的表達(dá)。

2)trp啟動(dòng)子：色氨酸啟動(dòng)子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被3-β-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)。

3)tac啟動(dòng)子：是lac和trp啟動(dòng)子的雜交分子，比兩者都要強(qiáng)，同樣可以被IPTG所誘導(dǎo)。

4)λPL啟動(dòng)子：是負(fù)責(zé)λDNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子之一。λPL啟動(dòng)子是可以被E.coliRNA聚合酶所識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)錄噬菌體DNA。該啟動(dòng)子可以被λcI基因產(chǎn)物所抑制。攜帶λPL啟動(dòng)子的載體使用溫度敏感的E.colicI突變體。在較低的溫度下，突變體所產(chǎn)生的cI蛋白可以抑制λPL啟動(dòng)子，在較高的溫度下，蛋白失活可以導(dǎo)致克隆基因的轉(zhuǎn)錄。45抗體的表達(dá)原理7/20/2023啟動(dòng)子下游的SD序列啟動(dòng)子下游需有SD(ShineandDalgarno)序列，這段序列是核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的一部分．研究發(fā)現(xiàn)SD序列為UAAGGAGG時(shí)比AAGGA翻譯效率高，起始密碼子ATG與SD序列UAAGGAGG的最適距離為6-8bP，與AAGGA的距離5-7bP為好，在分泌表達(dá)時(shí)需要有前導(dǎo)序列，大腸桿菌中比較常用的幾種前導(dǎo)肽序列為pelB(果膠酶基因)、OmpA(外膜蛋白基因)、OmpF等，使用何種前導(dǎo)肽對(duì)產(chǎn)量影響并不大。46抗體的表達(dá)原理7/20/2023解釋SD序列SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。原核生物中，核糖體受一段富含嘌呤的SD序列引導(dǎo)從而識(shí)別AUG起始密碼。這段位于AUG上游的序列和30S核糖體亞基的16srRNA一段序列互補(bǔ)，保守區(qū)5'-UAAGGAGGUGA-3'，核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS和起始密碼AUG之間的距離以及堿基的組成對(duì)翻譯的效率有顯著影響，在設(shè)計(jì)的時(shí)候要注意。而真核生物的那段保守序列成為Kozak序列（5'-GCCACCAUGG-3'），要高效翻譯，+1G和-3A就很重要。不過如果mRNA沒有這段Kozak序列而有一段適當(dāng)長度5'UTR也能夠有效地在無細(xì)胞體系中得到翻譯。有趣的是，還有數(shù)據(jù)提示，大腸桿菌的核糖體通常只認(rèn)得SD序列，而真核比如網(wǎng)織紅細(xì)胞的核糖體能識(shí)別Kozak序列，也能識(shí)別SD序列。47抗體的表達(dá)原理7/20/202348抗體的表達(dá)原理7/20/2023表達(dá)產(chǎn)物中需要加入tag在表達(dá)產(chǎn)物中加入標(biāo)簽序列(tagsquence)后可以方便地利用ELISA等常規(guī)的免疫學(xué)方法進(jìn)行活性檢測、定量及親和層析純化產(chǎn)物；通常這段標(biāo)簽位點(diǎn)都置于產(chǎn)物的C-末端，這樣一般不會(huì)影響抗體片段的活性，在進(jìn)行直接ELISA時(shí)也能保持標(biāo)簽位點(diǎn)的活性。目前常用的標(biāo)簽序列有組氨酸串、FLAG、c-myc10肽及Strep標(biāo)簽。組氨酸串為5-6個(gè)組氨酸，它可以與Ni+、Zn2+及Co+等陽離子結(jié)合，因此帶有His的抗體片段可以通過金屬螯合層析49抗體的表達(dá)原理7/20/202350抗體的表達(dá)原理7/20/2023富集、純化。疏水性多肽序列DYKDDDDK被稱為“FLAG”．也可用于檢測和純化重組蛋白，它的特點(diǎn)是既可置于N末端，又可置于C末端。C-myc10肽是鼠單克隆抗體9E10的結(jié)合表位．該標(biāo)簽的特點(diǎn)是特異件很高。Strep是一段合成的9肽，其序列為AWRHPQFGG，它能與鏈親合素(streptavidin)結(jié)合，用于柱層析純化，其不足之處是只能連于C末端。經(jīng)改進(jìn)的streptagII(SNWSHPQFEK)的親和力有所降低，但可以連于N端發(fā)揮作用。51抗體的表達(dá)原理7/20/2023二、重組抗體片段的可溶表達(dá)

由于可溶表達(dá)的抗體可能對(duì)宿主菌產(chǎn)生毒性，因此可溶表達(dá)載體應(yīng)選用嚴(yán)格調(diào)控的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來降低本底，過強(qiáng)的啟動(dòng)子因?yàn)閷?duì)大腸桿菌的分泌、加工能力要求過高而并不能增加分泌表達(dá)的產(chǎn)量，有時(shí)甚至?xí)档涂扇鼙磉_(dá)的產(chǎn)量，誘導(dǎo)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間也會(huì)影響產(chǎn)物的正確折疊，多數(shù)情況下可以利用降低溫度來增加可溶表達(dá)的產(chǎn)量，經(jīng)驗(yàn)值為24-32度。52抗體的表達(dá)原理7/20/202353抗體的表達(dá)原理7/20/2023(一)可溶表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方案

從新鮮涂布的平板上挑取單菌落，在起始培養(yǎng)基中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的豐富培養(yǎng)基(2YT或LB)中培養(yǎng)，如果要進(jìn)行更大體積的培養(yǎng)，則應(yīng)將單菌落接種在4ml豐富培養(yǎng)基中37度培養(yǎng)4-8h，然后再以此培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至大量培養(yǎng)基。如需過夜培養(yǎng)應(yīng)該在30度或更低溫度下培養(yǎng)，而不宜在37度培養(yǎng)過夜。誘導(dǎo)在37度培養(yǎng)至OD600約為0.4-1.0時(shí)開始進(jìn)行。誘導(dǎo)條件因啟動(dòng)子不同而異，參見表7-2。加入誘導(dǎo)物后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3h或過夜培養(yǎng)．誘導(dǎo)進(jìn)行的時(shí)間取決于啟動(dòng)子的特性和誘導(dǎo)溫度。以下列出不同溫度下誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間的經(jīng)驗(yàn)值：15-25度過夜誘導(dǎo)、30度誘導(dǎo)5-6h或更長時(shí)間、37度誘導(dǎo)3-4h。54抗體的表達(dá)原理7/20/2023（二）可溶表達(dá)條件的優(yōu)化1質(zhì)粒拷貝數(shù)（適中）2mRNA的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3抗體片斷的折疊與組裝55抗體的表達(dá)原理7/20/2023第三節(jié)抗體在酵母及昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)一、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)及其在基因工程抗體中的應(yīng)用

1以重組桿狀病毒為載體的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)。

2桿狀病毒表達(dá)載體（宿主細(xì)胞為sf9）

3桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的效率與加工能力

4穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)56抗體的表達(dá)原理7/20/2023多核多角體病毒MNPV特點(diǎn)：1具完整的感染性2不依賴輔助病毒3表達(dá)產(chǎn)物多半可溶4在自然界生存時(shí)間短暫，安全。5不能感染脊椎動(dòng)物。57抗體的表達(dá)原理7/20/2023Invitrogen公司58抗體的表達(dá)原理7/20/2023新式桿狀病毒和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)：外源基因表達(dá)產(chǎn)量高（1-500mg/L）；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)條件簡單；昆蟲病毒宿主范圍窄，不感染脊錐動(dòng)物細(xì)胞，具較高的安全性。轉(zhuǎn)化方式：同源重組：磷酸鈣共沉淀法59抗體的表達(dá)原理7/20/2023啟動(dòng)子：多角體蛋白啟動(dòng)子：非常強(qiáng)，其控制的外源蛋白的表達(dá)可達(dá)到細(xì)胞蛋白的30％。P10蛋白啟動(dòng)子已有系統(tǒng)：Clontech公司的BacPAKTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，IPLB-Sf21Cells，提供兩個(gè)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：pBacPAK8和pBacPAK960抗體的表達(dá)原理7/20/2023

BaculoDirect?

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)重組桿狀病毒最快和最容易的方法不需要煩瑣的細(xì)菌轉(zhuǎn)化和bacmid的分離，或是將轉(zhuǎn)移載體和線性桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲細(xì)胞。經(jīng)過生物工程改造的BaculoDirect?線性DNA（桿狀病毒基因組），利用快速和有效的Gateway?

重組反應(yīng)代替了這些煩瑣的工作。使用BaculoDirect?系統(tǒng)，從最初的反應(yīng)混合物的轉(zhuǎn)染到桿狀病毒苗的分離，只需要花費(fèi)大約8小時(shí)――僅花費(fèi)了不到傳統(tǒng)方法一半的時(shí)間！61抗體的表達(dá)原理7/20/2023

BaculoDirect?系統(tǒng)利用快速、簡便的Gateway技術(shù)。

BaculoDirect?線性DNA包含了attR位點(diǎn)，允許與包含有目的基因的Gateway?入門克隆進(jìn)行有效的重組。將entry克隆、BaculoDirect?線性DNA和Gateway?

LR

Clonase?酶混合物稍加混勻，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)即可。最終的反應(yīng)混和物中包含有攜帶目的基因的桿狀病毒，可以直接用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞（sf9或sf21）。62抗體的表達(dá)原理7/20/2023酵母表達(dá)載體63抗體的表達(dá)原理7/20/2023一、外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)特點(diǎn)：酵母生長快，易培養(yǎng)，成本低，遺傳操作方便，對(duì)外源蛋白能進(jìn)行翻譯后修飾和加工。畢赤酵母利用AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子或者3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）啟動(dòng)子，可高效表達(dá)外源基因。畢赤酵母的細(xì)胞密度可達(dá)150g/L畢赤酵母可進(jìn)行糖基化，糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser/Thr）64抗體的表達(dá)原理7/20/2023

畢赤酵母表達(dá)外源蛋白通常步驟：外源基因表達(dá)載體的構(gòu)建載體DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞篩選表達(dá)載體染色體整合的菌株撿出外源蛋白表達(dá)情況優(yōu)化發(fā)酵條件建立高密度發(fā)酵方法建立外源蛋白純化工藝65抗體的表達(dá)原理7/20/2023二、酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母是一類單細(xì)胞真核生物，具備易于操作，遺傳背景清楚，生產(chǎn)成本低等原核生物的特點(diǎn)，又具有真核生物的折疊、分泌機(jī)制，可以完成真核生物特異的蛋白酶解、折疊、糖基化等翻譯后修飾過程。酵母的生長速度（1-3h/代）比昆蟲或其它動(dòng)物細(xì)胞（約ld/代）快許多，培養(yǎng)基成分簡單。使用無血清培養(yǎng)基更可以簡化蛋白產(chǎn)物純化過程，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最多的是釀酒酵母和畢赤酵母。釀酒是使用最早，應(yīng)用最廣的酵母菌株．但目前有被畢赤酵母取代的趨勢。與釀酒酵母相比．畢赤醉母有幾個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)，它的乙醇氧化酶基因（AOXI）是一個(gè)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控基因，啟動(dòng)活性高，滲漏低．在加人甲醇后可以迅速啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；它比釀酒酵母更適合高密度培養(yǎng)，這對(duì)于提高重組蛋白的產(chǎn)量至關(guān)重要；它的N–糖基化方式也更接近高等真核生物。對(duì)該體系的載體構(gòu)建、表達(dá)特點(diǎn)和體系優(yōu)化已經(jīng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。66抗體的表達(dá)原理7/20/202367抗體的表達(dá)原理7/20/2023（一）酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)在酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的載體可按復(fù)制形式分為Yip、Yrp、Ycp、Yep和YAC幾種。pPIC9K為常用的酵母表達(dá)載體，其組成元件如圖，一3所示。除AOXI啟動(dòng)子外．常用的還有GAL系列啟動(dòng)子；分泌表達(dá)還需要前導(dǎo)肽將產(chǎn)物引導(dǎo)至分泌途徑．酵母天然的前導(dǎo)肽不一定適用于所有外源蛋白，來源于釀酒酵母的α-MF前導(dǎo)肽為常用的前導(dǎo)肽。檢測或分離重組蛋白可以選擇His、c-myc等與大腸桿菌的質(zhì)粒載體相似的標(biāo)記序列。68抗體的表達(dá)原理7/20/2023

研究發(fā)現(xiàn)．在Ecoli中以包含體方式表達(dá)的蛋白在酵母中大都能可溶表達(dá)，征大腸桿菌中經(jīng)常發(fā)生的蛋白降解現(xiàn)象，在酵母中也有所改善。酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)量比原核表達(dá)系統(tǒng)要高．在適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)肽引導(dǎo)下可以分泌到培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基中的污染物種類很少．有助于簡化純化過程。

wood等于1985年就在釀酒酵母中成功地表達(dá)了能正確折疊、并且有生物功能的完整抗體分子。到目前為止，完整的抗體、抗體片段如Fab、ScFv等抗體分子均已在酵母中得到表達(dá)。分泌的重組抗體片段在酵母中也可以高水平表達(dá)。69抗體的表達(dá)原理7/20/2023(二)酵母表達(dá)抗體片段的局限

酵母可以完成和高等真核生物極其類似的O-糖基化及N-糖基化，但酵母的O和N-糖基的主要成分為甘露糖。N-糖基化時(shí)添加的糖鏈長度會(huì)影響所表達(dá)蛋白的性質(zhì)。在酵母中的糖鏈(>50個(gè)糖基)比哺乳動(dòng)物的糖鏈(<20個(gè)糖基)長許多，稱為過度糖基化。這種過度糖基化產(chǎn)生的長鏈可能會(huì)影響蛋白的折疊，影響抗體的活性，具有免疫原性。有人報(bào)道酵母表達(dá)的IgG抗體雖可以介導(dǎo)ADCC，但卻不能激活補(bǔ)體系統(tǒng)。70抗體的表達(dá)原理7/20/2023這類抗體分子還因?yàn)榭赡芫哂忻庖咴约霸谘褐幸妆幌贿m用于臨床治療?？贵w分子在酵母表達(dá)時(shí)會(huì)否發(fā)生過度糖基化以及這種過度糖基化是否合影響抗體的活性還很難確定。酵母表達(dá)系統(tǒng)的不足之處還在于它的分泌表達(dá)模式與高等真核生物的差別會(huì)造成某些蛋白不能正常分泌而滯留在分泌途經(jīng)中。這可能是因?yàn)榻湍笇?duì)前導(dǎo)肽的識(shí)別能力以及細(xì)胞器的功能與高等真核生物不同，改用酵母天然的前導(dǎo)肽可以改善某種蛋白的分泌狀況，但不具有普遍意義。71抗體的表達(dá)原理7/20/2023第四節(jié)動(dòng)植物表達(dá)系統(tǒng)一動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)二植物表達(dá)系統(tǒng)72抗體的表達(dá)原理7/20/2023一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)：能進(jìn)行復(fù)雜的蛋白翻譯后加工修飾73抗體的表達(dá)原理7/20/20231、影響外源基因在哺乳動(dòng)物表達(dá)的序列因素啟動(dòng)子：起始位點(diǎn)上游20bp處的TATA盒—RNA聚合酶開始裝配和轉(zhuǎn)錄的地方CAAT盒GC盒調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始。74抗體的表達(dá)原理7/20/2023增強(qiáng)子：增強(qiáng)子序列是決定基因表達(dá)強(qiáng)度基因表達(dá)空間與時(shí)序的重要元件。SV40增強(qiáng)子人巨細(xì)胞病毒（CMV）增強(qiáng)子逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR增強(qiáng)子75抗體的表達(dá)原理7/20/2023RNA剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子：內(nèi)含子一般含有決定基因表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)空專一性的構(gòu)件，一些啟動(dòng)子可和內(nèi)含子相互作用提高表達(dá)水平。5‘非翻譯區(qū)序列（5’UTR）：5’UTR的長度至少大于20bp起始AUG及其周圍序列：3‘非翻譯區(qū)（3’UTR）：76抗體的表達(dá)原理7/20/2023已發(fā)展和使用的病毒載體有：SV40病毒載體，腺病毒載體，多瘤病毒載體，牛痘痘苗賓服度載體，單純泡疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體，EB病毒載體，牛乳頭瘤病毒載體等。2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體77抗體的表達(dá)原理7/20/20233、篩選標(biāo)記基因是細(xì)胞產(chǎn)生特定的藥物抗性或產(chǎn)生熒光。常用的篩選標(biāo)記有：氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶（APH或neor），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（hyg），二氫葉酸還原酶（dhfr）等78抗體的表達(dá)原理7/20/20234、外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)方式瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：永久轉(zhuǎn)染79抗體的表達(dá)原理7/20/20235、外DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法病毒方式：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、泡疹病毒、腺病毒相關(guān)病毒

磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子聚合物法顯微注射，電轉(zhuǎn)移法、基因槍轉(zhuǎn)染：化學(xué)法：物理法：80抗體的表達(dá)原理7/20/2023四、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測：NorthernBlot，RNA雜交保護(hù)，RT-PCR蛋白翻譯水平的檢測：ELISA、WesternBlot，高壓液相，質(zhì)譜等生物活性的檢測：81抗體的表達(dá)原理7/20/2023第六章基因打靶概念：基因打靶，基因敲除，干細(xì)胞，基因敲入基因打靶的技術(shù)流程

82抗體的表達(dá)原理7/20/2023基因打靶胚胎干細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)打靶載體的構(gòu)建重組ES細(xì)胞的篩選嵌合體小鼠的制備基因敲除小鼠的建立Cre-loxP系統(tǒng)、FLP/FRT系統(tǒng)和條件性基因敲除基因敲入大規(guī)模ES細(xì)胞突變庫的建立83抗體的表達(dá)原理7/20/2023概念干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞（EmbryonicStemCell，ES)：ESC是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（InnerCellMass，ICM）或附置后胚胎原始生殖細(xì)胞（primordialgermcells,PGCs)分離克隆出來的一種具無限增殖能力和全向分化能力的干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的定義：84抗體的表達(dá)原理7/20/2023ES的特點(diǎn)：（1）全能性這個(gè)特點(diǎn)是ES細(xì)胞具有可塑性的基礎(chǔ)，優(yōu)于成年組織干細(xì)胞。（2）無限擴(kuò)增為實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用提供了大量的原材料或工具。（3）可操作性導(dǎo)入異源基因，報(bào)告基因或標(biāo)志基因，誘導(dǎo)某個(gè)基因突變，基因打靶或?qū)腩~外的原有基因使之過度表達(dá)。85抗體的表達(dá)原理7/20/2023胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）：是一種具有分化潛能的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下能無限分裂并保持其全能性。一定培養(yǎng)條件下，ES細(xì)胞能在體外形成擬胚胎，具中胚層、內(nèi)胚層和外胚層特征。將ES細(xì)胞注入小鼠囊胚，該囊胚能在體內(nèi)發(fā)育成嵌合小鼠，注入的ES細(xì)胞能發(fā)育成小鼠的各個(gè)組織器官，包括生殖細(xì)胞。ES細(xì)胞的這些特點(diǎn)為原位定點(diǎn)改造小鼠個(gè)體的基因組創(chuàng)造了可能。86抗體的表達(dá)原理7/20/2023基因打靶：是利用同源重組技術(shù)來定點(diǎn)改變物種的基因組順序和結(jié)構(gòu)，從而在突變的個(gè)體內(nèi)來研究基因及基因組的功能。87抗體的表達(dá)原理7/20/2023基因敲除：是使基因組中某個(gè)/某幾個(gè)基因或基因的順式元件產(chǎn)生缺陷，從而在突變體內(nèi)喪生正常的功能，來推測這些基因或元件原來在體內(nèi)的功能?；蚯萌耄涸趥€(gè)體基因組中定點(diǎn)加入某個(gè)/某幾個(gè)基因或順式元件，使之表達(dá)或發(fā)揮作用，從而研究該基因或順式元件在體內(nèi)的功能。88抗體的表達(dá)原理7/20/2023基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。它的產(chǎn)生和發(fā)展建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)成就的基礎(chǔ)之上，并促進(jìn)了相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。自1987年早期胚胎干細(xì)胞技術(shù)建立及第一例基因剔除小鼠誕生以來，基因打靶的研究進(jìn)展迅速，給現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究帶來了革命性的變化，并直接引發(fā)了現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域中許多突破性的進(jìn)展，成為后基因組時(shí)代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。89抗體的表達(dá)原理7/20/2023

基因打靶流程圖90抗體的表達(dá)原理7/20/2023一、胚胎干細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)基因打靶中用的小鼠ES細(xì)胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均來源于129小鼠品系和其雜交品系。ES623和B6-IIIES細(xì)胞系，來源于C57BL/6小鼠品系。BALB/c-I，來源于BALB/c小鼠品系常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞為PMEF（小鼠原代胚成纖維細(xì)胞）91抗體的表達(dá)原理7/20/2023ES細(xì)胞的培養(yǎng)（1）沖洗子宮獲得胚泡（2）分離胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)組織培養(yǎng)法、免疫外科學(xué)法、顯微外科學(xué)法（3）體外培養(yǎng)有飼養(yǎng)層培養(yǎng)：STO(一種已建株的胚胎成纖維細(xì)胞),經(jīng)絲裂霉素C或射線處理，終止其分裂，但能分泌促進(jìn)ESC分裂抑制其分化的因子。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)：利用各種能分泌抑制分化因子的細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基，或向其中加入LIF（白血病抑制因子）。1、基因打靶用ES細(xì)胞的建株92抗體的表達(dá)原理7/20/2023組織培養(yǎng)法分離胚胎干細(xì)胞93抗體的表達(dá)原理7/20/2023123ES細(xì)胞94抗體的表達(dá)原理7/20/2023轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗體

在大腸桿菌、酵母或昆蟲細(xì)胞中都很難獲得與哺乳動(dòng)物翻譯后修飾、加工，特別是糖基化方式一致的重組抗體。在細(xì)胞培養(yǎng)條件下的蛋白表達(dá)與活體條件下的表達(dá)和調(diào)控也有很大區(qū)別。用于抗體規(guī)?；a(chǎn)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)的成本過高會(huì)制約其應(yīng)用，小規(guī)模培養(yǎng)時(shí)這個(gè)問題更為突出。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)重組抗體可以解決這一難題。目前轉(zhuǎn)基因方法很多，在轉(zhuǎn)基因小鼠上廣泛應(yīng)用的主要有兩種方法：①當(dāng)基因整合位點(diǎn)不是主要因素時(shí)，將DNA直接注射到受精卵的精核中可以向小鼠基因組引入新基因；②把DNA引入胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的培養(yǎng)物中，這種辦法通過基于同源重組的基因敲除來獲得目的基因的穩(wěn)定表達(dá)，這兩種轉(zhuǎn)基因的過程見圖7-6。95抗體的表達(dá)原理7/20/2023(一)乳腺特異的調(diào)控序列

目前主要是在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺中表達(dá)外源蛋白，在乳腺中表達(dá)的抗體片段大多是與乳腺特異調(diào)控序列融合表達(dá)的嵌合蛋白，許多編碼乳汁成分蛋白的調(diào)控區(qū)被用于重組蛋白在乳腺中的定位表達(dá)，如羊的β-乳球蛋白，牛的β-酪蛋白等。這些調(diào)控序列在應(yīng)用時(shí)對(duì)抗體的表達(dá)量無太大影響，也沒有明顯的種屬特異性，但相同的抗體片段融合于不同的調(diào)控區(qū)時(shí)，表達(dá)量有所差異。用于表達(dá)的抗體基因既可以是包括內(nèi)含子的基因組DNA，也可以用cDNA。然而將外源抗體的cDNA序列連在這些調(diào)控區(qū)下游時(shí)卻很難獲得高效表達(dá)，選用較大的基出組片段(<20kb)效果要好許多。96抗體的表達(dá)原理7/20/2023（二)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的選擇小鼠、羊、牛和雞等多種動(dòng)物都可用于轉(zhuǎn)基因的研究和生產(chǎn)。選擇何種動(dòng)物主要考慮產(chǎn)量和所表達(dá)抗體的性質(zhì)。97抗體的表達(dá)原理7/20/202398抗體的表達(dá)原理7/20/2023植物表達(dá)系統(tǒng)

利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)重組蛋白始于20世紀(jì)80年代，伴隨這項(xiàng)技術(shù)的日臻完善，出現(xiàn)了諸如“分子農(nóng)業(yè)”以及“變植物為工廠)”等概念。在植物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的抗體稱為植物抗體(plantibody)，它們可以是FV、ScFv、Fab乃至全長抗體，要獲得臨床前及I期臨床實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因植物約需2年左右時(shí)間。利用植物表達(dá)外源蛋白有許多優(yōu)點(diǎn)，首先植物繁殖能力強(qiáng)，可以利用愈傷組織或原生質(zhì)體連續(xù)培養(yǎng)．也可以從這些材料出發(fā)獲得再生植株，這方面已經(jīng)積累了很多的經(jīng)驗(yàn)。其次，大多數(shù)植物的基因轉(zhuǎn)化都是把外源DNA整合到基因組中去獲得轉(zhuǎn)基因植株，這樣就可以利用有性雜交在材料間轉(zhuǎn)移基因。99抗體的表達(dá)原理7/20/2023

在植物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最多的方法是農(nóng)桿菌介異的轉(zhuǎn)化。利用不同的啟動(dòng)子可以實(shí)現(xiàn)ScFv在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體及細(xì)胞間隙中的表達(dá)。農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因（nos）和花椰菜花葉病毒（CaMV)的35s啟動(dòng)子是常用的啟動(dòng)子．單子葉植物更多使用泛素的啟動(dòng)子。此外也可選擇組織器官特異的啟動(dòng)子，抗性基因的選擇以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（nptII），潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hpt）及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（cat）為主。也可以使用葡萄糖甘酸酶（GUS）及綠色熒光蛋白（GFP)等報(bào)告基因作為篩選標(biāo)記。pBin19是應(yīng)用較廣的Ti質(zhì)粒載體．其基本結(jié)構(gòu)如圖7-4。100抗體的表達(dá)原理7/20/2023Ti質(zhì)粒的特點(diǎn)101抗體的表達(dá)原理7/20/2023102抗體的表達(dá)原理7/20/2023Ti質(zhì)粒載體示意圖103抗體的表達(dá)原理7/20/2023（一）全抗體及Fab片段的表達(dá)

到目前為止IgG、IgM、IgA等多種形式的抗體和各類小分子抗體片段都可在植