預(yù)習(xí)放免方法設(shè)計(jì)

預(yù)習(xí)放免方法設(shè)計(jì)Page1第1頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月前言原理第2頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月前言

放射免疫方法的建立原則

根據(jù)分析目的和要求，通過對(duì)標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品（校準(zhǔn)品）的合理匹配，以及對(duì)反應(yīng)條件、分離方法的選擇，達(dá)到最滿意的效果第3頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月前言

放射免疫設(shè)計(jì)的目標(biāo)

根據(jù)要求使試劑的劑量反應(yīng)曲線在滿足靈敏度的情況下，是多數(shù)樣品得到較高的精密度。第4頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目錄靈敏度的設(shè)計(jì)反應(yīng)條件的選擇反應(yīng)方式的選擇分離方法的選擇方法學(xué)鑒定第5頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靈敏度的設(shè)計(jì)第6頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靈敏度的設(shè)計(jì)放射免疫分析的靈敏度Sensitivity指能測(cè)出的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最小值，通常指“0”標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率減兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的相應(yīng)劑量。第7頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靈敏度的設(shè)計(jì)放射免疫分析的靈敏度Sensitivity若以能測(cè)出的具有一定精密度的最小值為靈敏度的定義，則應(yīng)根據(jù)劑量反應(yīng)曲線的精密度圖（PDP），以CV%-10%的最小劑量為有效地可測(cè)量的最小劑量，即靈敏度。第8頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靈敏度的設(shè)計(jì)放射免疫分析的靈敏度Sensitivity影響因素標(biāo)記物的比活性抗體的親和力和用量劑量反應(yīng)曲線濃度范圍第9頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記物的用量標(biāo)記物的用量∝計(jì)數(shù)率計(jì)數(shù)誤差靈敏度統(tǒng)計(jì)漲落樣品保持一定的計(jì)數(shù)率①減少樣品化學(xué)量②適當(dāng)比活性、穩(wěn)定的標(biāo)記物第10頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記物的用量最佳標(biāo)記抗原的選擇方法用不同濃度的標(biāo)記抗原作一系列的抗血清實(shí)驗(yàn)，直到標(biāo)記物減少不再使曲線再右移，此時(shí)標(biāo)記物濃度稱“減弱濃度”，即為加入標(biāo)記抗原化學(xué)量的最低濃度。第11頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抗血清的用量放射免疫分析抗血清的鑒定指標(biāo)高親和力高滴度高特異性選用親和常數(shù)大，滴度高的抗血清第12頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抗血清的用量確定抗血清用量的方法第13頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抗血清的用量確定抗血清用量的方法抗血清滴度曲線

B/T01020304050607080結(jié)合率為30%-50%的抗血清稀釋度

第14頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抗血清的用量確定抗血清用量的方法做兩條抗體稀釋度曲線A.單純標(biāo)記抗原B.標(biāo)記抗原中加入微量非標(biāo)記抗原

兩條曲線分離度最大時(shí)抗體稀釋度，即為最佳稀釋度?？紤]了標(biāo)記抗原與抗原免疫活性是否一致第15頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線的濃度范圍可影響反應(yīng)曲線的斜率根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系的要求以及稀釋曲線確定第16頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線的濃度范圍可影響反應(yīng)曲線的斜率根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系的要求以及稀釋曲線確定最低標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)與標(biāo)記物的用量接近，B/B0=80-90%最大濃度劑量點(diǎn)的結(jié)合率為10-20%待測(cè)物的正常濃度范圍應(yīng)在劑量反應(yīng)曲線的直線部分第17頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線的濃度范圍第18頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線的工作范圍工作范圍由PDP圖確定工作范圍與劑量反應(yīng)曲線的濃度范圍是兩個(gè)不同的概念第19頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線的工作范圍工作范圍確定方法：A.CV%<10%的劑量區(qū)段為有效工作范圍第20頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線的工作范圍工作范圍確定方法：結(jié)合率（B/B0%）在20-80%之間的區(qū)段為工作范圍

為劑量反應(yīng)曲線接近直線的部分，待測(cè)物的正常范圍應(yīng)在該區(qū)段以內(nèi)。

第21頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)試劑劑量關(guān)系第22頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)試劑劑量關(guān)系一般規(guī)律靈敏度增加工作范圍減小第23頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)試劑劑量關(guān)系一般規(guī)律靈敏度下降工作范圍較大第24頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)試劑劑量關(guān)系比較抗原濃度和抗體濃度的最佳匹配數(shù)學(xué)模型推倒

最適抗體濃度q=3/K

最適標(biāo)記抗原濃度*Ag=4/K經(jīng)驗(yàn)確定（常用于實(shí)際工作）

①通過一定量的標(biāo)記抗原作抗體滴度試驗(yàn)，確定抗血清稀釋度

②通過劑量反應(yīng)曲線的制作進(jìn)行逐步調(diào)整，最后達(dá)其最佳相互關(guān)系第25頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)配的制備標(biāo)準(zhǔn)品介質(zhì)系統(tǒng)應(yīng)與待測(cè)樣品一致或近似如，待測(cè)為血清樣本，最好用零值血清制備標(biāo)準(zhǔn)品若用緩沖液制備標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)加入一定量的蛋白質(zhì)（1-2%的BSA）或明膠第26頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)條件的選擇第27頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)條件的選擇緩沖體系添加劑反應(yīng)體積溫育條件樣品處理第28頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月緩沖體系特異性結(jié)合反應(yīng)的親和常數(shù)受反應(yīng)介質(zhì)的pH和離子強(qiáng)度的影響第29頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月緩沖體系常見的緩沖體系磷酸鹽緩沖液（PBS）巴比妥緩沖液乙酸鹽緩沖液硼酸鹽緩沖液Tris-HCl緩沖液第30頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月添加劑目的：改善試劑的穩(wěn)定性/特殊需要要求：對(duì)特異性結(jié)合無影響常見添加劑EDTA-Na2ANSBSA/明膠抑肽酶疊氮鈉/硫柳汞第31頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)體積抗原抗體反應(yīng)∝反應(yīng)物濃度減小反應(yīng)體積，利于提高反應(yīng)濃度，提高實(shí)驗(yàn)靈敏度體積過小，易出現(xiàn)加樣誤差，形成放射性復(fù)合物的量亦減少，測(cè)量誤差增加常規(guī)選用反應(yīng)體積為：0.3ml-1.2ml第32頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月溫育條件反應(yīng)的平衡常數(shù)與溫度相關(guān)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度，包括整個(gè)分析至離心過程測(cè)定指標(biāo)不同，其對(duì)溫度的依賴程度亦不同溫度與反應(yīng)速度相關(guān)提高反應(yīng)溫度，可加速反應(yīng)，但親和力下降4℃抗體親和力最大，但反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)目前多采用較短時(shí)間37℃或室溫孵育第33頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月樣品處理

樣品中可能存在各種干擾物質(zhì)，或影響特異性反應(yīng)的物質(zhì)。故許多分析系統(tǒng)需要對(duì)分析樣品進(jìn)行預(yù)處理，常用的預(yù)處理方法是稀釋或提取。第34頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)方式的選擇第35頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)方式平衡法順序飽和法即時(shí)法第36頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)方式平衡法AbAgAg*加入分離劑Ag*AbAg*方法學(xué)評(píng)價(jià)

穩(wěn)定、重復(fù)性好、劑量反應(yīng)曲線具有競(jìng)爭(zhēng)性分析的典型特征，靈敏度相對(duì)較低

第37頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)方式順序飽和法(非平衡競(jìng)爭(zhēng)體系)AbAg平衡Ag*AbAg*AgAg*Ab終止反應(yīng)方法學(xué)評(píng)價(jià)

靈敏度較高，但因第二次孵育時(shí)間較短，要求標(biāo)記抗原的比活性較高，并且要求分離方法更為精細(xì)。

因存在兩次溫育，曲線偏離典型特征，且反應(yīng)穩(wěn)定性較差。

第38頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)方式即時(shí)法

在反應(yīng)尚未達(dá)完全平衡時(shí)終止反應(yīng)，并進(jìn)行分離測(cè)定。

要求：需嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間。

第39頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離方法的選擇第40頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離系統(tǒng)

分離系統(tǒng)應(yīng)依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇。其對(duì)放射免疫分析的結(jié)果影響較大，分離不全或錯(cuò)分都可造成劑量反應(yīng)曲線異常。

不同分離方法NSB差異較大，亦可影響反應(yīng)的靈敏度，因此，選擇適宜的分離系統(tǒng)更是建立放射免疫系統(tǒng)的重要步驟之一。第41頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離系統(tǒng)常用的分離體系125I3H雙抗體-PEG/固相分離法活性炭吸附法第42頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月方法學(xué)鑒定第43頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月方法學(xué)鑒定劑量反應(yīng)曲線穩(wěn)定性檢查靈敏度檢查精密度檢查健全性檢查正常參考范圍確定臨床有效性檢查第44頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月方法學(xué)鑒定劑量反應(yīng)曲線穩(wěn)定性檢查NSB/TB0/T截距/斜率EDPDP圖第45頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月方法學(xué)鑒定劑量反應(yīng)曲線穩(wěn)定性檢查靈敏度檢查精密度檢查健全性檢查正常參考范圍確定臨床有效性檢查第46頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月QCXSD12345678910L3.310.253.203.523.563.113.282.503.03.403.523.0M10.51.2511.710.611.511.110.39.6010.69.807.908.70H30.82.