核磁共振新技術(shù)課件

核磁共振新技術(shù)及其應用

核磁共振概述核磁共振新技術(shù)及應用2020/12/21概述

核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段，由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品，并具有迅速、準確、分辨率高等優(yōu)點而得以迅速發(fā)展和廣泛應用，已經(jīng)從物理學滲透到化學、生物、地質(zhì)、醫(yī)療以及材料等學科，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大作用。核磁共振是1946年由美國斯坦福大學布洛赫(F.Bloch)和哈佛大學珀賽爾(E.M.Purcell)各自獨立發(fā)現(xiàn)的，兩人因此獲得1952年諾貝爾物理學獎。60多年來，核磁共振已形成為一門有完整理論的新學科。2020/12/22精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點的難點，你是否會認為老師的教學方法需要改進？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”412位因?qū)舜殴舱竦慕艹鲐暙I而獲得諾貝爾獎科學家1944年I.Rabi1952年F.Block1952年E.M.Purcell1955年W.E.Lamb1955年P(guān).Kusch1964年C.H.Townes1966年A.Kastler1977年J.H.VanVleck1981年N.Bloembergen1983年H.Taube1989年N.F.Ramsey1991年R.R.Ernst2020/12/25核磁共振光譜：以頻率為兆赫級、波長很長、能量很低的電磁波照射分子，電磁波能與暴露在強磁場中的磁性核相互作用，引起磁性核在外磁場中發(fā)生磁能級的共振躍遷而產(chǎn)生吸收信號。與其他光譜方法一樣，屬于波譜分析?！?

原子核的磁性1、原子核的自旋原子核由質(zhì)子和中子組成，與核外電子一樣存在自旋。原子核繞軸自身作旋轉(zhuǎn)運動，產(chǎn)生自旋角動量P。由量子力學計算，P的絕對值由核自旋量子數(shù)I決定。核磁共振原理2020/12/26式中：h是普朗克常數(shù),6.62410-34J/SI是核的自旋量子數(shù),I=0，

P=0，無自旋，不能產(chǎn)生自旋角動量，不會產(chǎn)生共振信號。

只有當I

＞0時，才能發(fā)生共振吸收，產(chǎn)生共振信號。

說明：

I為核自旋量子數(shù)也簡稱核自旋，其數(shù)值隨核而異。（1）核內(nèi)質(zhì)子數(shù)和中子數(shù)都為偶數(shù)時，I=0，觀察不到核磁共振現(xiàn)象（2）核內(nèi)質(zhì)子數(shù)和中子數(shù)均為奇數(shù)時，I為正整數(shù)。（3）核內(nèi)質(zhì)子數(shù)中子數(shù)一奇一偶時，I為半整數(shù)。后兩類是核磁共振研究的主要對象。2020/12/27I的取值可用下面關(guān)系判斷：

質(zhì)量數(shù)（A）

原子序數(shù)（Z）

自旋量子數(shù)（I）

奇數(shù)奇數(shù)或偶數(shù)

半整數(shù)n+1/2。n=0,1,2,…奇數(shù)

整數(shù)

偶數(shù)

偶數(shù)0例如：

2020/12/28半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生一小磁場。當加一外磁場，這些原子核的能級發(fā)生分裂，這一物理現(xiàn)象稱為塞曼效應。在外磁場B0中塞曼分裂圖：2020/12/292、原子核的核磁矩

核自旋產(chǎn)生磁場，其方向由右手定則確定，如圖所示。核磁矩由下式確定：式中：為磁旋比。不同的核，其值不同；為核磁矩；P為自旋角動量圖1核磁產(chǎn)生磁場的方向?qū)⑹酱耄旱玫剑?020/12/2103、核磁在外磁場中的行為1）核磁與外磁場H0之間的作用能P是空間量子化的，在坐標Z軸上的分量Pz取分立的值：式中：m是原子核的磁量子數(shù)，其值等于﹣I,I+1,…I-1,I。故能取(2I+1)個值Pz的各個值相相差的整數(shù)倍，因此是不連續(xù)的，是空間量子化的。H0Mi=

Mi=EE2=﹣H0E1=﹢H0E圖21H在外磁場中的取向能級2020/12/211以1H核為例，無外磁場H0作用，排列是隨機的，磁性相互抵消；加上外磁場H0時，1H有序排列。排列方式有(2I+1,I=1/2)種，即兩種取向，分別對應兩個自旋量子數(shù)Mi=1/2。外磁場H0與核的作用能:E=

H0兩種取向?qū)獌蓚€能級：當與H0同向時，E=

-H0；當與H0反向時，E=

﹢H02020/12/212核磁矩在外磁場中的能級分布2020/12/213兩能級差為：

E=E2-E1=2H0將式代入得：2)、拉摩進動(Lamor)

在外磁場旋轉(zhuǎn)的原子核，其自旋軸與外磁場方向之間有一傾角。外磁場的作用使核磁受到一個垂直核磁矩的扭力，這樣原子核就圍繞外磁場的方向回旋，猶如在重力場中運動的陀螺。這種運動方式稱為拉摩進動。圖3、(a)自旋陀螺在重力場中的進動工(b)自旋原子核在外磁場中的進動2020/12/214進動角頻率：，進動線頻率：將式代入得：3）核磁共振的條件量子力學選律可知，只有m=1的躍遷，才是允許躍遷，所以相鄰兩能級之間的能量差：

E=E2-E1=2H0如果在磁場的垂直方向加一個射頻場，當射頻場的能量滿足條件：2020/12/215即核子從射頻場中吸收能量hv從低能級躍遷到高能級，發(fā)生核磁共振吸收。原子核在外磁場中吸收特定頻率電磁波的現(xiàn)象稱為核磁共振。公式的意義：1)對于不同的原子核，由于磁旋比不同，發(fā)生共振的條件不同。2)對于同一種原子核來說，值一定，共振頻率隨外磁場H0而改變。從式中可知道，觀察核磁共振吸收的方法有兩種：固定磁場強度H0而改變頻率，稱為掃頻法；固定電磁波頻率而改變磁場強度H0，稱之為掃場法。2020/12/2164、弛豫過程

1H的磁性核在電磁波的作用下，能級分裂為二。根據(jù)Boltzmann分配定律，處在低能級的原子核數(shù)目占有微弱的優(yōu)勢。如在外磁場（60MHz),溫度為27℃時，兩個能級上氫核數(shù)目N之比為：即每一百萬個氫核中低能級氫核數(shù)比高能級的多十個左右。雖然這種微弱的優(yōu)勢，使低能級的核在強磁場作用下吸收能量由低能級躍遷到高能級。隨著低能級的核數(shù)目的減少，吸收信號減弱直至消失，此為飽和。實際應用中，只要合理地選用照射制度，就可以連續(xù)觀察到NMR信號。使低能級上的核始終保持微弱多數(shù)的。因此必然存在使低能級的磁核始終保持微弱多數(shù)的內(nèi)在因素，即高能級的核必須放出能量回到低能級，從而使低能級的核始終占優(yōu)勢。2020/12/217弛豫過程（Relaxation）:是高能態(tài)的核以非輻射的形式放出能量回到低能態(tài)重建Boltzmann分布的過程。如果沒有弛豫過程，飽和現(xiàn)象容易發(fā)生。弛豫過程分為兩類：1）自旋－晶格弛豫（縱向弛豫）(Spin-latticeRelaxation）自旋核與周圍分子交換能量的過程。核周圍的許多小分子相當于許多的小磁體，這些小磁體的快速運動產(chǎn)生瞬息萬變的小磁場－波動磁場。某個波動磁場的頻率與核自旋產(chǎn)生的磁場頻率一致時，自旋核與波動磁場發(fā)生能量交換，將能量傳遞給周圍分子而跳回低能級，從而使低能級的核數(shù)目占有微弱的優(yōu)勢。因此總的結(jié)果是降低高能級的核數(shù)目。弛豫過程經(jīng)歷的時間愈短，自旋－晶格弛豫過程的效率愈高。氣體和液體樣品的t1很短，僅幾秒種。固體樣品因分子熱運動受到限制，T1很大，因此NMR常采用液體樣品。2020/12/2182）自旋－自旋馳豫(Spin-spinRelaxation)核與核之間的能量交換。高能態(tài)核把能量傳給同類低能態(tài)的自旋核，本身回到低能態(tài)，維持Boltzmann分布。結(jié)果是高低能態(tài)自旋核總數(shù)不變。自旋-自旋弛豫過程的半衰期用T2表示。液體T2～1s，固體或粘度大的液體，T2很小，10-4～10-5s2020/12/219§2

核磁共振譜線特征1、譜線的寬度1)自然寬度核磁并非靜止地固定在某個能級上，而是在兩個能級間躍遷，即在某個能級上的壽命是有限的，根據(jù)量子力學測不準關(guān)系：可知和。即越小，則越大，即譜線越寬。2）偶極加寬樣品中含有大量的磁核，并在其周圍產(chǎn)生磁場，從而被測原子核除受磁場的作用外，還受相鄰核所產(chǎn)生的磁場的作用，而有一分布，從而使譜線變寬。2020/12/2203）非均勻加寬實際上在樣品體積范圍內(nèi)的外磁場并非均勻分布，而是在某個數(shù)值范圍內(nèi)有微小差別，從而在樣品體積范圍內(nèi)各部分原子核的共振頻率值也不同，導致譜線變寬。4）馳豫加寬和調(diào)制加寬自旋－晶格馳豫過程使原子核在給定的能級中的平均壽命減少，當然譜線加寬。用連續(xù)波測定NMR吸收時，往往改變磁場，相當于加了一個調(diào)制，從而產(chǎn)生一定的頻譜，也使譜線變寬。2譜線的線型溶液中的NMR譜線的線形為羅倫茲型；固態(tài)中的NMR譜線的線形為高斯型。2020/12/2213譜線的強度

在1HNMR譜中，一般譜線的強度正比于產(chǎn)生此峰的數(shù)目，據(jù)此可以進行定量測定。如CH3CH2OH中CH3、CH2、OH基團質(zhì)子峰的相對強度比為3：2：1，恰好是這些基團所含質(zhì)子數(shù)之比。但在C13NMR中，因分子中各個C13核所受影響的各因素各不相同，從而使譜峰的強度一般不與產(chǎn)生各譜線的C13核數(shù)成正比。2020/12/2224、化學位移的基本原理1）化學位移的產(chǎn)生由核磁共振條件，從理論上講，某種原子核的共振頻率只決定這種原子核的磁旋比和外磁場強度，同類核應有相同的共振頻率。如果是這樣，核磁共振對研究分子結(jié)構(gòu)就沒有意義。1950年發(fā)現(xiàn)：磁性核的共振頻率不僅取決于核的磁旋比和外部磁場強度，而且受到核周圍的分子環(huán)境的影響，從而使各種不同類的氫原子所吸收的頻率有所不同如圖所示圖各種不同氫的化學位移2020/12/223產(chǎn)生這種差別在于被測原子核周圍的化學環(huán)境，化學環(huán)境是由于氫核外圍電子云對核的屏蔽作用引起的。電子屏蔽效應化學位移是由核外電子的屏蔽效應引起的。2020/12/224原子核在分子中不是完全裸露的，而是被價電子所包圍的。核外電子在與外磁場垂直的平面上繞核旋轉(zhuǎn)的同時，會產(chǎn)生與外磁場方向相反的感生磁場。感生磁場的大小用表示。為屏蔽常數(shù)，與核外電子云的密度有關(guān)。核實際感受到的磁場強度（有效磁場Hi）

核的共振頻率為：

同一分子內(nèi)同類核的化學環(huán)境不同，不同，因此化學位移不同2020/12/225核外電子對H核產(chǎn)生的這種作用，稱為屏蔽效應(又稱抗磁屏蔽效應)。

顯然，核外電子云密度越大，屏蔽效應越強，要發(fā)生共振吸收就勢必增加外加磁場強度，共振信號將移向高場區(qū)；反之，共振信號將移向低場區(qū)。因此，H核磁共振的條件是：2020/12/2262)化學位移表示方法不同環(huán)境中的質(zhì)子的共振頻率雖有差異，但差異很小，約為百萬分之十。在測定共振頻率時，常常要求幾個赫茲的準確度，目前還不能精確測定。因此，采用相對數(shù)值。測定樣品與標準物質(zhì)的吸收頻率之差，此差值為化學位移。常以四甲基硅（TMS）為標準物質(zhì)，規(guī)定：它的化學位移為零，然后，根據(jù)其它吸收峰與零點的相對距離來確定它們的化學位移值。零點-1-2-31234566789TMS低場高場2020/12/227常用的標準物質(zhì)：四甲基硅(TMS)：

2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸鈉(DSS)：2020/12/228TMS作為標準物的優(yōu)點：TMS分子有12個相同化學環(huán)境的氫，NMR信號為單一尖峰，少量的TMS即可測出NMR信號。Si電負性比C低，TMS質(zhì)子處在高電子密度區(qū)，產(chǎn)生較大的屏蔽效應。TMS的化學性質(zhì)不活潑，與樣品不發(fā)生化學反應和分子間的締合。TMS容易溶于有機溶劑，沸點低，樣品容易回收。TMS不溶于重水，用重水測譜時，用其他標準物如2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸鈉(DSS)2020/12/229（1）用赫茲表示化學位移CH3CCl2CH2Cl的H1NMR(60MHZ,100MHz)譜說明，同一質(zhì)子在不同儀器上，用赫茲表示的化學位移是不同的，不容易進行比較。因此，該法須注明所用儀器的射頻值。CH3CCl2CH2Cl的H1NMR(60MHZ,100MHz)譜2020/12/230（2）用位移常數(shù)表示化學位移固定磁場，改變頻率樣品和標準的共振頻率：頻率差：化學位移：2020/12/231頻率固定，磁場改變(掃場法)樣品和標準的共振磁場：因此位移可表示為：化學位移用表示，以前也用表示，與的關(guān)系為：

=10-單位為ppm。2020/12/2323)影響化學位移的因素誘導效應化學鍵的各向異性共軛效應濃度、溫度、溶劑對δ值的影響溶劑對δ值的影響2020/12/233同一化合物在不同溶劑中的化學位移會有所差別，這種由于溶質(zhì)分子受到不同溶劑影響而引起的化學位移變化稱為溶劑效應。溶劑效應主要是因溶劑的各向異性效應或溶劑與溶質(zhì)之間形成氫鍵而產(chǎn)生的。由于存在溶劑效應，在查閱或報道化合物的核磁共振數(shù)據(jù)時應該注意標明測試時所用的溶劑。如果使用的是混合溶劑，則還應說明兩種溶劑的比例。溶劑效應2020/12/234活潑氫的化學位移化合物類型（PPM)化合物類型（PPM)醇0.5-5.5Ar-SH3-4酚(分子內(nèi)締合)10.5-16RSO3H11-12其它酚4-8RNH2,R2NH0.4-3.5烯醇(分子內(nèi)締合）15-19ArNH2,Ar2NH,ArNHR2.9-4.8羧酸10-13RCONH2,ArCONH25-6.5RC=NOH7.4-10.2RCONHR’,ArCONHR6-8.2R-SH0.9-2.5RCONHAr,ArCONHAr7.8-9.42020/12/235氫譜化學位移數(shù)值已有較完善總結(jié)經(jīng)驗公式計算機預測化學位移圖表和計算公式2020/12/236核磁共振譜儀簡介核磁共振譜儀發(fā)展過程圖為核磁共振譜儀示意圖。它主要由以下部分組成：磁鐵：永久磁鐵和電磁鐵只能產(chǎn)生100MH以下磁場強度，更高磁場強度用超導磁體。射頻振蕩器：其線圈垂直于磁場，能產(chǎn)生頻率與磁場強度相應的射頻振蕩。1H常用的60,90,100MH的電磁波。射頻接受器：與振蕩器線圈垂直，并與掃場線圈垂直。探頭和樣品管座：探頭中有射頻振蕩線圈、射頻接受線圈，樣品管插于探頭內(nèi)。2020/12/237核磁共振波譜儀原理1．永久磁鐵：提供外磁場，要求穩(wěn)定性好，均勻，不均勻性小于六千萬分之一。掃場線圈。2．射頻振蕩器：線圈垂直于外磁場，發(fā)射一定頻率的電磁輻射信號。3．射頻信號接受器（檢測器）：當質(zhì)子的進動頻率與輻射頻率相匹配時，發(fā)生能級躍遷，吸收能量，在感應線圈中產(chǎn)生毫伏級信號。4．樣品管：外徑5mm的玻璃管,測量過程中旋轉(zhuǎn),磁場作用均勻2020/12/238從最初的NMR譜儀，經(jīng)歷了三次大的革命，由不同類型的NMR波譜儀，可按不同的方式進行分類。a.按激發(fā)和接收方式可分為：連續(xù)波發(fā)射，分時發(fā)射和脈沖發(fā)射譜儀；b.按磁體的性質(zhì)分為：永磁、電磁和超導波譜儀；連續(xù)波永磁譜儀結(jié)構(gòu)簡單，易于操作，但靈敏度太低，70年代初發(fā)展了電磁體NMR譜儀使磁場強度一直加大，高時可達100兆，磁體重2.7噸，而且耗電量也很大。c.隨著超導技術(shù)、電子技術(shù)和計算機技術(shù)的發(fā)展，脈沖付里葉變換高分辯超導NMR儀在近二十年來發(fā)展很快。場強由88年的600兆，94年的750兆，98年的800兆至2000年10月900兆。

2020/12/239核磁共振儀器2020/12/240從NMR實驗技術(shù)看經(jīng)歷了四個過程

a、—維1H譜，連續(xù)波檢測小分子結(jié)構(gòu)；b、脈沖付里葉變換實驗，檢測1H，13C和一些多核譜圖，如31P，15N等等（場強較高下完成）；c、二維、三維和多維譜的發(fā)展

隨著超導磁體的引入，計算機及電子技術(shù)的進一步發(fā)展，使得二維和多維核磁共振技術(shù)在80年代末，90年代初發(fā)展很快，各種多脈沖實驗層出不窮，NMR技術(shù)變得更完善，更多樣化和更有針對性的研究分析樣品。d、梯度場的發(fā)展

脈沖梯度場技術(shù)是90年代初用于NMR譜儀分析研究的，一經(jīng)應用于NMR分析，其優(yōu)點很快的體現(xiàn)出來了，如利用梯度脈沖探頭可以在3分鐘之內(nèi)測試一個H-HCOSY。勻場是做好NMR譜圖的關(guān)鍵，也是每個NMR操作者的基本功，以前為了勻場有時需要幾十分鐘或更長時間，現(xiàn)在只需40多秒。

2020/12/241實驗技術(shù)的新進展

1、譜儀向高場發(fā)展

2、實驗方法的最新進展

3、探頭的改進

1）魔角MASNano探頭2）超低溫探頭利用高溫超導薄膜材料而制成的超導低溫探頭，當樣品溫度由溫控單元維持時，采用閉環(huán)或開環(huán)制冷系統(tǒng)使超導線圈冷到25K，消除了譜圖的電噪聲，提高了檢測靈敏度。是常規(guī)探頭的四倍。相對常規(guī)5mm探頭而言，其潛在靈敏度可以提高8～10倍。國內(nèi)已有此類探頭使用，500兆信噪比可達到3200：1，可達到800兆水平。

4、LC-NMR聯(lián)用技術(shù)及其應用

2020/12/242核磁共振新技術(shù)

核磁雙共振

二維核磁共振NMR成像技術(shù)極化轉(zhuǎn)移技術(shù)魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)

高效液相色譜與核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）2020/12/243核磁雙共振

雙核自旋系統(tǒng)檢測器2擾動1脈沖雙共振是同時用兩種頻率的射頻場作用在兩種核組成的系統(tǒng)上，第一射頻場B1使某種核共振，第二射頻場B2使另外一種核共振，這樣兩個原子核同時發(fā)生共振。復雜分子的NMR譜由于同類核及不同核的偶合作用，使被測核的峰分裂為多重峰，不僅降低了譜線的強度而且各多重分裂峰彼此重合在一起給譜的解釋帶來很多困難。因此在測定NMR譜時，使自旋體系樣品同時受到兩個不同頻率的射頻場作用，分別用于被測核A的共振吸收以及與被測核A有偶合作用的核B去偶合，使觀察到的NMR譜如同未發(fā)生偶合作用一樣。

第二射頻場為干擾場，通常用一個強射頻場干擾圖譜中某條譜線，另一個射頻場觀察其他譜線的強度、形狀和精細結(jié)構(gòu)的變化，從而確定各條譜線之間的關(guān)系，區(qū)分相互重疊的譜線。2020/12/244二維核磁共振及多維核磁共振

二維核磁共振使NMR技術(shù)產(chǎn)生了一次革命性的變化，它將擠在一維譜中的譜線在二維空間展開（二維譜）,從而較清晰地提供了更多的信息。

2020/12/245核磁共振成像術(shù)是80年代發(fā)展起來的一種全新的影像檢查技術(shù)。它的全稱是：核磁共振電子計算機斷層掃描術(shù)(簡稱MRI--CT或者MRl)。1971年，美國人達曼迪恩提出，將核磁共振用于醫(yī)學的診斷，當時，未能被科學界所接受。然而，僅僅10年的時間，到1981年，就取得了人體全身核磁共振的圖像。使人們長期以來，設(shè)想用無損傷的方法，既能取得活體器官和組織的詳細診斷圖像，又能監(jiān)測活體器官和組織中的化學成分和反應的夢想終于得以實現(xiàn)。核磁共振完全不同于傳統(tǒng)的X線和CT，它是一種生物磁自旋成像技術(shù)，利用人體中的遍布全身的氫原子在外加的強磁場內(nèi)受到射頻脈沖的激發(fā)，產(chǎn)生核磁共振現(xiàn)象，經(jīng)過空間編碼技術(shù)，用探測器檢測并接受以電磁形式放出的核磁共振信號，輸入計算機，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理轉(zhuǎn)換，最后將人體各組織的形態(tài)形成圖像，以作診斷。2020/12/246

核磁共振所獲得的圖像異常清晰、精細、分辨率高，對比度好，信息量大，特別對軟組織層次顯示得好。使醫(yī)生如同直接看到了人體內(nèi)部組織那樣清晰、明了，大大提高了診斷效率。避免了許多以往因手術(shù)前診斷不明而不得不進行的開顱、開胸、開腹探查及其他的一些探查診斷性手術(shù)，使病人避免了不必要的手術(shù)痛苦以及探查性手術(shù)所帶來的副損傷及并發(fā)癥。所以它一出現(xiàn)就受到影像工作者和臨床醫(yī)生的歡迎，目前已普遍的應用于臨床，對一些疾病的診斷成為必不可少的檢查手段。核磁共振提供的信息量不但大于醫(yī)學影像學中的其他許多成像術(shù)，而且不同于已有的成像術(shù)，它是一項革命性的影像診斷技術(shù)。因此，它對疾病的診斷具有很大的潛在優(yōu)越性。2020/12/247極化轉(zhuǎn)移技術(shù)靈敏核非靈敏核檢測（非靈敏核）J脈沖序列1脈沖序列2

極化轉(zhuǎn)移(PT)是一種非常實技術(shù)，它用二種特殊的脈沖序列分別作用于非靈敏核和靈敏核兩種不同的自旋體系上。通過兩體系間極化強度的轉(zhuǎn)移，從而提高非靈敏核的觀測靈敏度，基本的技巧是從高靈敏度的富核處“借”到了極化強度。2020/12/248在NMR測定中，為取得高質(zhì)量的譜圖，要求磁場均勻，樣品的填充因子高，磁化率均勻，前兩個因素可以通過硬件研制不斷改善，而磁化率均勻與否則與樣品性質(zhì)、數(shù)量及周圍環(huán)境直接相關(guān)，這樣，當樣品量有限時,就必須考慮磁化率的均勻性。

1982年，魔角旋轉(zhuǎn)（MAS）開始用于高分辨工作，此后，將MAS用于小體積微量樣品引起了興趣，實驗表明運用MAS可以消除固體及非均相溶液中磁化率不同而造成的譜線加寬。樣品應以相當或大于1.8kHz轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)，可使邊帶得到有效抑制，根據(jù)這些結(jié)果，成功地設(shè)計了新型的超微量探頭。

超微量探頭的發(fā)展概況

2020/12/249魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)

在固體中自旋之間的耦合較強，共振譜較寬，掩蓋了其他精細的譜線結(jié)構(gòu)，耦合能大小與核的相對位置在磁場中的取向有關(guān)，其因子是(3cos2β-1)，如果有一種方法使β=θ=54.440（魔角），則3cosβ-1=0，相互作用減小，達到了窄化譜線的目的。魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)就是通過樣品的旋轉(zhuǎn)來達到減小相互作用的，當樣品高速旋轉(zhuǎn)時β與θ的差別就會平均掉。2020/12/25090年代中，一種與常規(guī)高分辨液相探頭設(shè)計完全不同的超微量探頭（目前稱之為NanoNMRProbe，下同）問世了，這種探頭與常規(guī)固體高分辨探頭也不盡相同，后者為高功率，高速魔角旋轉(zhuǎn)用于消除化學位移各向異性和使偶極偶合平均化，對于磁化率的不連續(xù)性是不考慮的。另外，常規(guī)MAS探頭對線寬要求僅為5Hz（甚至50Hz），而1H微量探頭因為1H核本身總的譜寬窄，要求線寬＜0.5Hz（CDCl3在丙酮-d6）中，特殊設(shè)計的NanoNMRprobe，其成功之處在于將體積很小的樣品（＜40μL），能100%地保持在檢測線圈內(nèi)，并確保填充因子高，和均勻的磁化率，以得到最高靈敏度，構(gòu)成探頭的物料也必須使磁化率的不連續(xù)性達到最小，才能達到最小的線寬。NanoNMRProbe2020/12/2512020/12/252超微量探頭的結(jié)構(gòu)原理

NanoNMRProbe內(nèi)腔長28mm，魔角（54.7°），轉(zhuǎn)速在1.5~2.0kHz之間，為保持長期穩(wěn)定性，帶有2H鎖線圈，并有變溫功能，探頭種類有直接檢測用的1H和13C{1H}和間接檢測用的1H{13C}探頭，樣品體積最大為40μL，可取得線形好，靈敏度高和分辨率最佳的譜圖，若樣品量很少，溶劑量可相應減少，保持樣品有一定濃度，溶劑雜質(zhì)及偽峰不會增加，還可提高動態(tài)范圍，只要氘代試劑的量能保證場一頻聯(lián)鎖，即使樣品溶液體積未充滿整個樣品管（40μl），也不會使勻場變壞，或使譜線變寬，確保取得高質(zhì)量的譜圖。2020/12/253NanoNMRProbe的應用1、超微量樣品的測定樣品量不同的薄荷醇,分別為為40μg，4μg和400ng，溶于CD2C12中,采樣次數(shù)分別為4次,400次和32240次.2020/12/2542、Nano探頭在組合化學中的應用組合化學是近二十年發(fā)展起來的一種快速合成與篩選大量化合物的新方法，其在發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化藥物先導化合物的過程中發(fā)揮了重要作用。組合化學包括了組合合成、群集篩選和對感興趣化合物結(jié)構(gòu)解析的三大步驟。因而有“平行”合成技術(shù)、“混-分”合成技術(shù)、編碼-解碼技術(shù)、“一珠一化合物”技術(shù)、“位置掃描”技術(shù)、天然寡聚物的生物組合合成及篩選技術(shù)、“動態(tài)化學庫”技術(shù)、“多樣性”導向的組合合成技術(shù)、“Microarray”技術(shù)、組合配基裝配、“非天然”天然組合化學庫合成技術(shù)等等。在多種合成方法中，“一珠一化合物”技術(shù)最大的優(yōu)點是化學庫的空間可分離性，亦即化學庫中所有的化合物同時并存且相互獨立，因而，這種樹脂珠-化學庫的方式可直接用于固相篩選法。2020/12/255利用該技術(shù)在短時間內(nèi)迅速合成并篩選的化合物可以達到幾千萬這樣的天文數(shù)字，大大加快了發(fā)現(xiàn)藥物先導化合物的步伐。但是在產(chǎn)物分析中，由于樹脂引起磁場的不均勻，常規(guī)的NMR技術(shù)受到了限制。較早的做法是將反應的中間體或最終產(chǎn)物從樹脂上切落下來，再利用常規(guī)方法進行分析和鑒定。這種方法費時，費樣，而且經(jīng)常破壞化合物的結(jié)構(gòu)，得出錯誤的信息。九十年代初發(fā)展的高分辨魔角核磁共振技術(shù)(Highresolutionmagicanglespinning(HR/MAS)NMR)可以克服樹脂引起的磁場不均勻性,得到最高靈敏度和最小線寬的NMR譜圖。該技術(shù)不破壞樣品，可靈敏、直接地提供偶聯(lián)在樹脂上化合物的結(jié)構(gòu)信息。

2020/12/256頂部譜圖用常規(guī)5mm液體高分辨探頭91．1mg干樹脂，掃描一次中部譜圖：用常規(guī)5rnm固體CP／MAS探頭，樹脂樣品為20.2mg．轉(zhuǎn)速為3.8kHz，掃描8次底部譜圖：用Nano探頭，樹脂用量僅為5.4mg，魔角轉(zhuǎn)速為2kHz，掃描8次2020/12/257目前，廣泛用于：監(jiān)測固相合成反應；指導反應條件的優(yōu)化;鑒定固載在單一樹脂珠上化合物的結(jié)構(gòu)；以及分析樹脂上固載化合物的構(gòu)象等等。高分辨魔角核磁共振是組合化學中有用的分析工具，可以跟蹤固相有機合成反應，快速直接地提供連在樹脂上的化合物的結(jié)構(gòu)信息，指導反應條件的優(yōu)化，它能直接簡便地定量反應的產(chǎn)率，而這種分析方法恰恰在常規(guī)NMR中很難實現(xiàn)。

2020/12/258高效液相色譜與核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）1、LC-NMR技術(shù)發(fā)展概況①NMR譜儀的靈敏度較低；

②系統(tǒng)無法應付較大的動力學范圍；③流動檢測池和探頭沒有商品化以及溶劑峰壓制效果不理想。

2020/12/2592、LC-NMR聯(lián)用技術(shù)的軟硬件及原理1）計算機軟件支持

2）LC-NMR聯(lián)用的相關(guān)硬件a.NMR流動探頭

b.HPLC系統(tǒng)c.峰敏技術(shù)d.在線/離線組份收集器

2020/12/2603、技術(shù)問題及解決措施

動力學范圍不夠?qū)捝V分辨率的喪失HPLC-NMR通信NMR靈敏度解決方法：1）流速、檢測池及探頭2）溶劑峰壓制2020/12/261

不同的溶劑峰壓制技術(shù)大都是基于化學位移和馳豫時間的不同而設(shè)計的，理想的峰壓制技術(shù)應滿足以下幾點要求：（1）消除溶劑峰而不干擾所要的信號（2）不影響峰壓制區(qū)域以外的信號強度（3）能同時壓制多個溶劑峰（4）易于實現(xiàn)以避免損失測試信號（5）在梯度HPLC體系中能跟隨溶劑信號位置改變而改變

WET序列，已經(jīng)可以成功地完成HPLC-NMR中使用普通試劑而必需的峰壓制2020/12/2624、LC-NMR的操作模式及其應用1）操作模式

a連續(xù)流動：在洗脫過程中，溶劑組成不斷變化，給峰壓制造成一定困難，另外樣品停留時間短，靈敏度低，一般只適用于1H和19F測試。b停止流動：顧名思義即使溶液停留于檢測池中進行測試。當組分的保留時間已知，或者HPLC-NMR采用靈敏的在線檢測器時，可以采用這種方法。

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c分時止流：按一定的時間間隔暫停流動相，來檢測NMR譜。這種方法在被檢組分沒有UV發(fā)色團時尤其適用。通過HPLC-NMR譜，也可以估計色譜峰的純度。d收集分析：色譜洗脫峰被預先收集到一個樣品池中，然后進行離線NMR檢測。e紫外激發(fā)：這種方法主要是利用軟件技術(shù)，在UV檢測到組分峰時，經(jīng)過計算將樣品組分準確地滯留于檢測池中，并通過NMR進行采樣。2020/12/2652）應用范圍a在藥物代謝研究中應用b食品化學c高聚物分析d在天然產(chǎn)物化學中的作用e環(huán)境化學中的應用2020/12/266藤黃酸大鼠膽汁代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確證研究藤黃酸是從中藥藤黃中分離得到的化合物，其抗癌作用與一般的化療抗癌藥物有所區(qū)別，實驗研究結(jié)果表明，藤黃酸對多種腫瘤顯示較強的抗腫瘤活性，并在有效計量范圍內(nèi)毒副作用比較小，對腫瘤細胞的抑制有非常高的選擇性，能選擇性的殺死癌細胞，而對正常動物造血系統(tǒng)和免疫功能沒有影響，這是目前腫瘤化療藥物所不具備的。藥代動力學研究已顯示，藤黃酸在腫瘤組織中有較高的分布和較長的持續(xù)時間。

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藤黃酸HPLC分析的色譜條件

A空白膽汁色譜圖BII代謝物分析色譜圖CI相代謝物分析色譜圖D藤黃酸色譜圖藤黃酸在大鼠膽汁中可檢測到2個主要代謝產(chǎn)物，即代謝物1（MT1，Rt=17.996min）和代謝物2（MT2,Rt=19.557min）。2020/12/268LC-NMR的分析條件采用Varian公司的Prostar-230高效液相色譜儀，分析柱為InertsilODS-3柱(150×4.6mm)。流動相為D2O:CH3OH=85:15。流速為1ml/min，檢測器為VarianProstar-330二極管陣列檢測器，紫外檢測波長為280nm。將服藥膽汁樣品溶于200μl甲醇和水的混合溶劑中。在INOVA-500LC-NMR上，用停止流動的方法分別采集LC-1HNMR譜。進樣量為25μl，采用WET方式壓制溶劑峰。譜寬7500Hz，1H譜采樣時間為1.5s，馳豫時間為1s，采樣數(shù)據(jù)點16K，累加次數(shù)為256。

2020/12/269MS圖譜MT1的ESI-MS給出[M-1]-為m/z645，故其分子量為646，與藤黃酸（628）相比，質(zhì)量數(shù)多18，可能為藤黃酸的羥基化物。代謝產(chǎn)物2的LC-MS譜給出MT2的[M-H]-峰為m/z643，故其分子量為644。比藤黃酸質(zhì)量數(shù)(628)多16。2020/12/270MT1(上圖)，MT2(中圖)和藤黃酸(下圖)LC-1HNMR低場區(qū)信號比較2020/12/271代謝物1(MT1)的結(jié)構(gòu)分析

（1）高場區(qū)：MT1的1H-NMR譜高場區(qū)示有多個甲基信號(δ1.73(6H,s),1.66,1.65,1.63,1.56,1.36,1.35(each3H,s))，與藤黃酸類化合物的1HNMR譜特征相符。（2）低場區(qū)藤黃酸的10位烯質(zhì)子的信號(7.56(1H,d,J=6.9Hz))在MT1的1HNMR譜中消失，而MT1在δ4.65(1H,br.d,J=4.0Hz)處顯示一個含氧取代基的偕位質(zhì)子信號，據(jù)此推斷MT1為藤黃酸的10位羥基化產(chǎn)物。(3)MT1氫譜的低場區(qū)的27,32,37-H的信號也與藤黃酸有明顯不同，藤黃酸中27-H(δ5.96(1H,t,J1=J2=7.2Hz))的信號在MT1中向低場位移至δ6.52(1H,t,J1=J2=7.2Hz)，而原本重疊在一起的32,37-H(δ5.25(2H,m))也分成為兩個多重峰（δ5.05and5.25(each1H,m)。這與10位有含氧取代基的化合物的氫譜特征相吻合（見表3-1），故斷定MT1為10-羥基-藤黃酸。2020/12/272代謝物2(MT2)的結(jié)構(gòu)分析

MT2的LC-1HNMR譜符合藤黃酸類化合物的氫譜特征。在其氫譜上，δ7.4左右沒有雙峰出現(xiàn)，因此藤黃酸結(jié)構(gòu)中的?9，在MT2的結(jié)構(gòu)中消失。MT2的氫譜上在4.4ppm出現(xiàn)一個質(zhì)子的d峰信號，偶合常數(shù)約為4Hz,這與MT1的10-H信號非常相似，因此判斷MT2的10位亦存在含氧取代基。由于MT2僅比藤黃酸多一個氧，因此推測MT2可能為藤黃酸的9,10-環(huán)氧衍生物.

2020/12/273藤黃酸MT1MT210-甲氧基藤黃酸2020/12/274在景洪哥納香提取混合物中的應用研究景洪哥納香(Groniothalamus．Cheliensis)為番茄科哥納香屬植物，據(jù)文獻報道，哥納香屬植物中富含苯乙稀比喃類化合物，該類化合物具有抗癌用．目前已從自然界中分離得到70余種該類化合物。2020/12/275儀器及實驗條件

景哥洪納香(20kg)用95％的酒精提取3次，所得浸膏(1300g)在索式提取器中，先后用石油醚，氯仿、乙酸乙酯萃取．氯仿部分(315g)用硅膠柱層析，以CHCL3：乙酸乙酯梯度洗脫，得到105mg混合物．采用Varian公司的Prostar一230高效液相色譜儀，分析柱為InertsilODS一3柱(250×46mm)．流動相為D2O，CH2CN，采用梯度洗脫，0～1min時其洗脫比例為D2O：CH3CN=68：32，逐漸增加乙腈的比例至25min時達到D2O：CH3CN=40：60，至45min時達到D2O：CH3CN=20：60．流速為1mL／min，檢測器為VarianProstar一330二極管振列檢測器，紫外檢測波長為254nm將5mg混合物樣品溶于200μL乙腈和水的混合溶劑中2020/12/2762020/12/2772020/12/2782020/12/2792020/12/280結(jié)果與討論苯乙稀吡喃類化合物在δ6.00～7.00為雙鍵上的稀質(zhì)子，δ4.00～5.00為環(huán)上連氧環(huán)質(zhì)子，δ7.00～7.80為單取代的苯質(zhì)子．通過對HPLC-NMR得到的HNMR譜分析,得到各譜均符合苯乙稀吡喃類化合物的特征．4，5，6色譜峰有兩套雙鍵上的稀質(zhì)子信號，如果為雙倍體，每對δ6.00～7.00雙鍵上的稀質(zhì)子比例應相同，但現(xiàn)在比例不同，4，5，6色譜峰的HNMR譜為混合物HNMR．2020/12/281其中5號色譜蜂HNMR譜有兩套雙鍵上的稀質(zhì)子信號δ7.033，δ6.080和δ7．033，6．210;兩套乙?；〈|(zhì)子5．492，5．370，10個苯質(zhì)子δ7.00～7.80兩套,δ4.00～5.00有2個質(zhì)子,也是兩套.這兩套質(zhì)子比例均為2:1.，認為該結(jié)構(gòu)為哥納香三醇或類似物2020/12/2826號峰HNMR譜中含有5號峰所有信號及另一套雙鍵上的稀質(zhì)子信號δ7．033．6．080，δ5．734有一個質(zhì)子信號．二者比例為1：4．因此認為該物質(zhì)可能為苯乙烯或類似物.2020/12/283．4號峰HNMR譜所含信號與5號色譜蜂HNMR譜類似，但是不含乙酰基取代質(zhì)子，在較低場(4．00以下)含質(zhì)子信號．認為該結(jié)構(gòu)為哥納香二醇或類似物2020/12/284核磁共振技術(shù)在新藥篩選中的作用

1.合理性藥物設(shè)計合理性藥物設(shè)計是以了解生物大分子（如蛋白質(zhì)）的三維結(jié)構(gòu)及其相關(guān)的分子識別為基礎(chǔ)的。然而，小分子配體和蛋白質(zhì)進行分子識別形成復合物的過程并非象鑰匙和鎖的模型那樣簡單，而是一個雙重誘導契合（double-inducedfit）的過程

蛋白質(zhì)-配體雙重誘導契合模型示意圖

2020/12/2852.非合理性藥物設(shè)計

快速篩選方法(高通量篩選:HTS)(high-throughoutscreening)優(yōu)點：無需知道蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)缺點：需要花費大量的時間和精力去建立針對一個或一類蛋白的檢定方法；所能檢測到的都是親和力相對較高的分子；要直接針對一個很大的化合物庫進行篩選；多種官能團的結(jié)構(gòu)多樣性問題以及酰胺和酯鍵限制藥物的生物利用度的問題也需要進一步解決2020/12/286SAR-by-NMR（Structure-activityrelationshipbyNMR）通過NMR將上述合理性藥物設(shè)計和非合理性藥物設(shè)計（組合化學）巧妙地結(jié)合起來，產(chǎn)生了一種極為有效的發(fā)現(xiàn)藥物靶分子高親和性配體的方法，稱為SAR-by-NMR。這種新方法結(jié)合了合理性設(shè)計中的配體設(shè)計和優(yōu)化方法（如LUDI）和非合理性設(shè)計(如組合化學)的合理因素，大大地提高了先導化合物發(fā)現(xiàn)的速度和有效性。

2020/12/287該方法利用15N標記的蛋白質(zhì)，和15N-1HHSQC實驗。由于小分子和蛋白質(zhì)結(jié)合后，會改變蛋白質(zhì)結(jié)合位點的局部化學環(huán)境，因此通過二維15N-HSQC譜中15N或1H的化學位移的變化可以檢測到是否有小分子域蛋白質(zhì)結(jié)合。同時配體和蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)可以通過化學位移的變化和配體濃度的關(guān)系測得。結(jié)合位點也可以由發(fā)生化學位移變化的原核子來確定。2020/12/288SAR-by-NMR原理示意圖2020/12/289SAR-by-NMR成功之處：1、使用了NMR實驗方法來辨別小分子和靶蛋白的結(jié)合，能夠很快地從小分子化合物庫中發(fā)現(xiàn)結(jié)合于靶蛋白亞活性位點的低親和性配體。2、可以通過蛋白質(zhì)特定酰胺信號的變化直接得到配體結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)信息。這一點首先對辨別小分子是結(jié)合在靶蛋白的不同亞位點上非常重要，同時，通過比較結(jié)合在同一亞位點的小分子的結(jié)構(gòu)，可以得到哪些官能團對結(jié)合有主要貢獻的信息，然后通過結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系對小分子進行優(yōu)化2020/12/2903、可以直接研究“變構(gòu)效應”即第一個亞位點配體存在下進行篩選時可能發(fā)現(xiàn)那些只有在第一個配體存在下才能和靶蛋白的其他亞位點結(jié)合的配體第二個配體(三角形)只有在另一個配體(橢圓形)存在的情況下才能和靶蛋白穩(wěn)定地結(jié)合2020/12/291“連接模式”策略ΔGAB=ΔGA+ΔGB+ΔGlink所謂“連接模式”，就是把親和性比較弱的單個分子片段通過連接橋連接起來，這樣得到的新的分子和靶蛋白結(jié)合時，將不僅僅是單個片段結(jié)合自由能的簡單相加這個策略成功的關(guān)鍵還在于所設(shè)計的連接橋的長度及其性質(zhì)（如剛性等）能否使ΔGlink達到最優(yōu)親和性為mM和μM數(shù)量級的小分子經(jīng)連接可得到nM甚至pM數(shù)量級的先導化合物在LUDI中完全是用從頭設(shè)計的方法選擇小分子片段并把它們連接起來，而在SAR-by-NMR中小分子片段是用NMR直接篩選得到的。和傳統(tǒng)的合理性設(shè)計相比，可以說，這是真正的合理性設(shè)計2020/12/292SAR-by-NMR與組合化學相比：相同：兩者都須經(jīng)過篩選大量化合物，都充分利用了有機化合物結(jié)構(gòu)多樣性的特點，從中獲得高活性的先導化合物。不同：組合化學是先制備由大量化合物組成的化合物庫，然后對這些化合物庫進行直接篩選；而SAR-by-NMR篩選的是未經(jīng)“組合”（連接）的小分子化合物庫，得到結(jié)合于靶蛋白亞活性位點的低親和性配體，經(jīng)優(yōu)化后再“組裝”成高親和性的配體。2020/12/293優(yōu)越之處：在組合化學中，要合成所有分子片段和不同連接橋“組合”起來的分子〔(分子片段1)×(分子片段2)×(不同連接橋)〕。而在SAR-by-NMR中，由于和蛋白結(jié)合的分子片段在連接之前先已被辨別出來，而且連接橋是基于結(jié)構(gòu)信息選擇的，所以只需進行少量的合成。2020/12/294應用實例

1、FK506結(jié)合蛋白（FKBP）的高親和性配體的發(fā)現(xiàn)2020/12/295發(fā)現(xiàn)第二個配體Kd=0.8mM2020/12/296優(yōu)化第二個配體2