免疫比濁分析（免疫學檢驗課件）

免疫比濁分析第一節(jié)免疫比濁技術原理免疫比濁技術分類：透射免疫比濁法（turbidimetricimmunoassay）散射免疫比濁法（nephelometryimmunoassay）速率散射比濁法終點散射比濁法一、透射免疫比濁法

當一定波長的光通過抗原抗體反應形成的免疫復合物時會因為反射和吸收而減弱，一定范圍內(nèi)，透射光被吸收的量與復合物的量呈正相關關系，而復合物的量與抗原抗體量為一定的函數(shù)關系。（一）基本原理

在抗原或抗體量一定的條件下，可以利用比濁儀在光源的光路方向上測定透射光強度與入射光強度的比值或吸光度，來判斷待測抗原的量，這種方法稱為透射比濁法

。透射免疫比濁法光路圖待測的抗原抗體復合物分子量足夠大。抗原抗體復合物數(shù)量足夠多。具有充分的反應時間。高親和力的抗體，并保證抗體過量。（二）技術要求

透射免疫比濁法的靈敏度是單向瓊脂擴散方法的5～10倍，但其與標記免疫分析技術相比還不夠高。因此，透射比濁類的自動分析儀用于免疫測定已趨減少，該測定原理主要用于生化分析儀。（三）方法學評價抗原抗體反應曲線二、散射免疫比濁法散射比濁法是指一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液時遇到其中的抗原抗體復合物，光線被粒子顆粒折射而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光。（一）基本原理

其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復合物的大小和多少密切相關。散射光的強度與復合物的含量成正比，即待測的抗原越多，形成的復合物越多，散射光就越強。散射免疫比濁法光路圖透射濁度法和散射濁度法的光路

應選擇適當?shù)墓庠磸姸?、反應時間、測量角度及光源的波長。另外，要注意保證抗原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子強度、pH值等。（二）技術要求

散射免疫比濁法是當今免疫化學分析中比較有優(yōu)勢的方法。可以實現(xiàn)自動化管理，但用于免疫沉淀反應有很多缺陷，如因為是一次性測定光吸收值，沒有考慮單個待測樣本的散射效果，可能使測定結(jié)果不準確。（三）方法學評價

測定的時間依然較長，且隨時間延長，抗原抗體復合物有重新結(jié)合的趨勢，可影響散射值的變化及存在反應本底，在微量測定時，本底的干擾是影響測定準確性的重要因素。速率散射免疫比濁法該法是抗原抗體結(jié)合反應的一種動態(tài)測定方法。將抗原抗體的沉淀反應與散射比濁分析相結(jié)合，對單位時間內(nèi)抗原和抗體結(jié)合形成復合物的速度進行動力學測定即為速率散射免疫比濁法。（一）基本原理

當抗體的濃度固定于一定范圍時，速度峰值的高低與抗原的含量成正比，隨著時間的延長，免疫復合物的量逐漸增多，抗原抗體結(jié)合速度的峰值在一定的時間出現(xiàn)。通過微機處理即可得到待測蛋白成份的含量。累計時間復合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500—512359080706055453020

抗原抗體復合物形成時間與速率的關系

速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時間與抗體濃度及純度直接相關，需選用抗體純度及親和力較高的試劑。此外，要保證待測樣本血清的性狀符合要求，如嚴重脂血等即為不合格樣本。（二）技術要求

該法具有快速、敏感度及精密度高的特點，其最大優(yōu)點在于快速，檢測不必等到抗原抗體達到平衡，檢測的是抗原抗體反應的第一階段，大大節(jié)省反應時間，每小時可檢測標本數(shù)十份；敏感度高，最小檢出量達微克/升水平。（三）方法學評價三、免疫膠乳比濁法將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，制成致敏的膠乳顆粒，當遇到相應抗原時，發(fā)生交聯(lián)反應，形成抗原抗體復合物，膠乳顆粒發(fā)生凝集。（一）基本原理

單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)并不阻礙光線透過，兩個及其兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過的光減少，其減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，即與待測抗原量呈正比，由此可檢測樣本中的特定抗原含量。

膠乳顆粒的均一性將直接影響光散射作用，影響檢測結(jié)果，因此需要選擇均勻一致的膠乳顆粒。此外，試劑需要加保護劑以提高其穩(wěn)定性，所用器皿要潔凈，避免雜質(zhì)微粒的干擾。（二）技術要求

該法敏感度高，試劑穩(wěn)定，個體免疫復合物對結(jié)果影響也小，因此結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好，精確度高，且不需要特殊的儀器設備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。（三）方法學評價（一）BN特種蛋白分析測定系統(tǒng)該系統(tǒng)的測定方法是散射免疫比濁法的一種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測前向角13～24度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收散射光信號，經(jīng)過微電腦處理，與標準曲線進行比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃度。第二節(jié)自動化免疫比濁分析一、主流免疫比濁設備概況1.測定原理

系統(tǒng)由分析儀、計算機、條碼讀取器、打印機四部分組成，其中分析儀是主要組成部分，包括散射測濁儀、自動加樣系統(tǒng)、運輸裝置和比色杯裝置。

2.儀器基本組成BN100、BNⅡ特種蛋白分析分析系統(tǒng)本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過量的前提下，光束通過抗原抗體復合物時所產(chǎn)生的散射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰值通過電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測抗原的濃度。1.測定原理（二）ARRAY分析系統(tǒng)ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機構成，其主要構成部分為分析儀，由加液系統(tǒng)、散射測濁儀、40孔樣本轉(zhuǎn)盤、20孔試劑轉(zhuǎn)盤、軟盤驅(qū)動器等組成。2.儀器基本組成Array360、IMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)二、免疫比濁分析的主要影響因素1．抗原抗體比例抗原抗體比例要適當。2．抗體的純度與效價診斷試劑應盡可能選擇高純度與高效價的抗體。3．免疫復合物的大小及穩(wěn)定性溶液中免疫復合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應該不容易相互聚集。4．增濁劑利用增聚劑破壞抗原抗體的水化層，促進反應的進行。5.離子強度PBS是較好的反應液。。。。。。。小結(jié)

經(jīng)典的免疫沉淀反應通常是在抗原抗體反應的終點