RNA提取及PCR相關技術

RNA提取逆轉錄實驗步驟結果分析PCRqPCR內容從RNA提取到基因定性/定量流程收集并保存組織、血液、細胞等臨床樣本提取、純化RNA逆轉錄生成cDNAPCR/qPCR進行定性/定量分析樣本保存要求最好使用新鮮樣品組織：取樣離體后，立即分成1cm3左右的小塊，

每塊約30-100mg，放入凍存管或錫箔紙包好，

立即放置液氮罐中速凍1小時，-80℃冰箱保存。注意做好標記，避免反復凍融第一部分RNA提取RNA提取樣本保存要求細胞：不建議保存。

培養(yǎng)處理后立即提取RNA， 或收集后，于Trizol液中-80℃保存。血液：不建議長期保存。

或立即分離白細胞后，于Trizol液中-80℃保存。試劑耗材準備工作目的：去除RNase，防止RNA降解?各種離心管、Tip頭、冷凍保存管等塑料器皿： 浸泡在0.1%的DEPC水中，過夜處理，次日烘干， 高壓滅菌后再次烘干。?錫箔紙、玻璃勻漿管、研缽、手術剪刀、鑷子、移液管等玻璃、金屬及陶瓷制品：用錫箔紙嚴密包裹后，150℃高溫烘烤4小時。前期準備工作?RNase-free水：0.1％DEPC處理去離子水過夜，次日高壓滅菌除去殘留DEPC，分裝1.5mlEppendorf管，4℃保存。?75％乙醇：用RNase-free水配制，分裝為50ml，4℃保存。?氯仿、異丙醇、無水乙醇：新包裝開封后，分裝50ml，4℃保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。樣本準備

組織

大鼠組織樣品量總RNA量（μg）腦10mg8肺10mg10腎臟10mg10心臟10mg20脾臟10mg35肝臟10mg4050－100mg組織對應1mlTrizol樣本準備

細胞?懸浮細胞：生長對數期誘導后，5000×g，5min離心去 除培養(yǎng)基，收集約5-10×106個細胞。

每5-10×106個細胞對應1mlTrizol

?貼壁細胞：生長對數期誘導后，收集約5-10×106個細 胞，倒掉培養(yǎng)基，加入預熱PBS洗一次，去 除PBS。每10cm2培養(yǎng)面積對應1mlTrizolRNA的提取注意佩戴口罩、勤更換手套

組織（1）液氮預冷研缽；（2）液氮研磨，至樣品呈粉末狀（需8-10min）；（3）向研缽內加入1mlTrizol繼續(xù)研磨，至呈不黏稠液態(tài)；（4）將混合液轉移至玻璃勻漿器中，冰上勻漿3min；（5）將勻漿液轉移至1.5mlEppendorf管，室溫孵育5min；裂解RNA的提取

細胞懸浮細胞：離心收集后，倒除培養(yǎng)液，加入1mlTrizol反復吹打細胞，至溶液不黏稠。

貼壁細胞：倒除培養(yǎng)液，PBS洗滌一次后，直接在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中加入1mlTrizol反復吹打細胞，直至溶液不黏稠。室溫孵育混合液10min后，轉移至1.5mlEppendorf管裂解Trizol勻漿孵育后－80℃保存加入0.2ml氯仿，劇烈搖動15s;3minatRT,12,000gx15min,4℃分層取水相，0.5mL異丙醇，顛倒混勻，10minatRT4℃，12,000gx10min（片狀沉淀物為RNA）沉淀去上清，1ml75％乙醇洗滌，7,500gx5minat4℃，重復一次洗滌空氣干燥，加50ulRNase-free水，55℃孵育溶解干燥溶解RNA提取優(yōu)化步驟（1）對得率較低的樣本，可在異丙醇沉淀一步，選用-20

度過夜孵育，以增加得率。（2）對多糖含量較高的樣本，可在異丙醇沉淀一步，加入

高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl），-20度過

夜共孵育，以去除多糖物質的污染。注意：所有試劑均需無酶水配制。RNA鑒定及初定量

（1）測量OD值——得率及純度檢測

得率

總RNA濃度（ug/ml）＝OD260×稀釋倍數×40ug/ml

（通常OD260數值介于0.15-1.0之間才可靠）

純度

OD260/280檢測RNA純度值在1.8-2.1之間，RNA純度較好；值小于1.8，表明蛋白雜質較多；值大于2.2，表明RNA已降解；RNA鑒定及初定量

（2）瓊脂糖凝膠電泳——RNA完整性鑒定

1－3ulRNA溶液上樣，1％膠，100V電泳10min。完整RNA呈現明顯兩條帶28S，18S，且28S帶約為18S帶亮度的兩倍；有時也可見5S帶RNA鑒定及初定量ElectrophoresisgeloftheRNAsample小結－RNA的保護1.提取前

1.1新鮮樣品及液氮速凍

1.2提取工作區(qū)RNase的清除

1.3實驗用品RNase的清除

2.提取中

2.1組織破碎過程中的保護

2.2細胞裂解過程中的保護

2.3實驗人員保護措施

2.4保存過程中3.在后續(xù)的逆轉錄過程中仍需保持無酶環(huán)境第二部分RT-PCR逆轉錄PCRreversetranscriptionAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’mRNA(sense)Antisenseprimers:oligo(dT)orrandomhexamersorGSP1ststrandcDNAAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’PCRusingGSP+GSP1GSP1GSPGSP1(sense)GSP(antisense)1ststrandcDNART-PCR逆轉錄?選擇方法：

兩步法（適用于多目的基因）

一步法（適用于單一目的基因）RNA逆轉錄

?選擇逆轉錄引物：

隨機引物（適用于低豐度RNA）

Oligo(dT)引物（適用于具有PolyA尾的RNA）

特異性引物（適用于一步法）

RNA逆轉錄步驟（1）取1-5ugRNA樣本，65℃熱變性10min；（2）配制反應體系，共20ul（以AMV為例）

10×buffer 2ul Mgcl2(25mM) 4ul dNTPs(10mM) 2ul RNaseinhibitor(1U/ul)0.5ul reversetranscriptase15U reverseprimer0.5ug RNAsample1-5ug RNase-freeWater加至20ul 一、逆轉錄反應RNA逆轉錄步驟（3）反應體系42℃孵育60min。如使用隨機引物，先室溫孵育

10min后，再升溫至42℃。（4）72℃，5min失活酶，置冰進行后續(xù)反應或-20℃保存。cDNA第一鏈已合成，可低溫保存或繼續(xù)后續(xù)實驗聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，以反應底物脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。PCR的原理和反應過程RT-PCR逆轉錄PCRPCR反應準備工作：

?目的基因擴增引物設計：NCBI中查詢靶基因的mRNA序列，無特

殊要求可選擇CDS序列作為引物設計區(qū)域。RT-PCR逆轉錄PCR?mRNA序列查找（以EGFR為例） RT-PCR逆轉錄PCR………………………………以BLAST驗證引物RT-PCR逆轉錄PCRPCR反應準備工作：?選擇內參：1.受不同實驗處理因素時，表達恒定；

2.在體內各種組織中表達恒定；

3.除實驗設計處理因素之外，能夠與目的基因一起受同等程度的非設計其它因素影響。

常用內參基因名稱：β-actin、GAPDH、16Sr、18Sr

（Human、Rat、Mouse）RT-PCR逆轉錄步驟二、PCR擴增（示例）cDNA第一鏈 2ul10×PCRbuffer(K+)5ul25mMMgCl23ul(1.5mM)10mMdNTPs1ul(各200uM)50μM引物正向/反向各0.5ul(0.1~0.5uM)Taq酶 0.5ul(1~5U)雙蒸水38.5ul總反應體積：50ulPCRmix包含：buffer（Mg2+）dNTPsTaq酶RT-PCR逆轉錄步驟PCR反應條件

95℃ 2min 95℃ 30sec 40-65℃ 10-120sec 22-35cycle 72℃ 60-120sec 72℃ 10min 12℃ ∞

退火溫度：引物的退火溫度一般要比估計的相應熔點溫度Tm低5℃左右。兩條引物的退火溫度相差不應超過4-6℃。特異性的改進：提高退火溫度（比建議退火溫度提高2-5℃）；減少退火時間。過長的退火時間在正常情況下并不能提高產量，只會增加非特異性引物雜交的可能性。注意事項（1）每次PCR設立對照組和陰性對照組。（2）科學做法是將內參引物加入目的基因的PCR擴增 反應體系中，同時擴增作為對照。（3）將反應體系中的相同試劑預先混合，再分裝成各反應管。（4）設定合適的循環(huán)次數，PCR不能進入平臺期。（5）在一定范圍內調整Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度，消除非特異性擴增。結果鑒定

瓊脂糖凝膠電泳分析結果：

2％瓊脂糖凝膠，取4-8ul產物上樣，60V電泳40min，紫外燈下觀察結果。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描，測定灰度值。注意：灰度掃描時，選擇合適的膠空白區(qū)域作為扣除的背景灰度值。基因表達的差異分析－相對定量各反應體系以內參基因為參照，計算待測基因產物與其灰度比值，作為待測基因的表達值。即

待測基因產物電泳帶灰度值 內參基因產物電泳帶灰度值

雙標準曲線法： 待測樣本基因相對表達量 參照樣本基因相對表達量＝待測基因相對表達量結果示例

結果示例熒光定量PCR(Real-timePCR,qPCR)PCR+熒光探針/熒光染料①應用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產物定量、基因表達研究、病原體檢測及PCR條件的優(yōu)化等。②可定量原理：經激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而達到定量目的。③無須凝膠電泳：只須反應管內直接檢測。④減少污染環(huán)節(jié)：全封閉反應管。⑤結果重現性好：定量動態(tài)范圍高達五個數量級。Log[DNA]循環(huán)數線性增長期Linear平臺期Plateauy=x(1+e)n指數增長期GeometricReal-timePCR相同模板進行96次擴增的擴增曲線圖起始拷貝數越高，Ct值越小；起始拷貝數越低，Ct值越大與DNA結合時發(fā)光游離時不發(fā)光

一種DNA小溝結合染料1．SYBRGreenI熒光染料

在PCR過程中染料與DNA結合發(fā)光聚合完成聚合開始SYBRGreenI每形成一個DNA雙鏈，就有一定數量的染料結合上去染料一結合，就產生熒光信號信號強度與DNA分子總數目成正比數量關系一條探針，兩條引物引物位于探針的兩邊一條探針，兩個基團前邊是報告基團，后邊是淬滅基團

3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'２．TaqMan探針/水解探針每產生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產生一個單位信號信號強度與結合探針的DNA分子數成正比數量關系5’TaqMan探針上游引物3’3’5’下游引物RQ3’5’3’5’QRReal-timePCR反應體系cDNA第一鏈 2ul10μM引物