第三章遺傳物質(zhì)的復制課件

1中心法則

(TheCentralDogma)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)復制SmallRNA2第三章遺傳物質(zhì)的復制

3第一節(jié)核酸復制的特征

第二節(jié)參與復制的酶和蛋白質(zhì)因子

第三節(jié)原核生物的復制機理

第四節(jié)病毒基因組復制的多樣性

第五節(jié)真核生物的DNA復制

第六節(jié)復制的忠實性41、按照堿基配對原則，以現(xiàn)有的DNA鏈為模板合成新拷貝；部分DNA是以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄的結(jié)果；2、核酸的生物合成只能從5’3’方向進行；3、特異的聚合酶類催化核酸的生物合成；4、聚合酶的底物核苷酸是5’-NTP或5’-dNTP；5、DNA聚合酶不能催化從頭開始合成DNA，必需具有引物。第一節(jié)核酸復制的特征一、核酸生物合成的一般規(guī)則5二、復制可能的幾種方式圖3-1三種不同的復制模型6圖3-2Meselson-Stahl實驗（a)實驗結(jié)果的解釋（b)CsCl梯度離心實驗（c)離心后DNA的吸收值Meselson-Stahl密度標記實驗

半保留復制的實驗證實(1)7

圖3-3Taylor蠶豆根尖放射自顯影實驗。

(a)按半保留復制預(yù)期DNA在復制過程中標記情況；(b)實驗結(jié)果染色體放射自顯影的圖示。半保留復制的實驗證實(2)8半保留復制（Semi-conservativeReplication）

DNA復制是分別以親代螺旋雙鏈中的一條為模板合成其互補鏈，由此產(chǎn)生的兩條子代雙螺旋都是由一條親代鏈和一條新合成鏈組成，因此稱做半保留復制。9

三、復制子、復制起始點與終止點1、復制子（replicon）:

1）復制子是基因組中

DNA分子的復制單位；2）復制子含有控制復制起始的特定位點，即復制起始點，以及控制復制終止的終止點。因此復制子是從復制起點到終止點的區(qū)域；3）細菌染色體、質(zhì)粒、病毒只有一個復制起點，整個DNA分子構(gòu)成一個復制子；真核生物染色體有多個起始點，含多個復制子。10Table1

EukaryoticrepliconsaresmallandreplicatemoreslowlythanbacterialDNA．112、復制起點(origin)1）原核生物的復制起點特征：通常富含A/T堿基對，常見回文序列和重復序列的結(jié)構(gòu)；復制起點中的順式DNA序列（反向重復順序）通過與特異的反式作用蛋白質(zhì)因子反應(yīng)激活復制；原核生物復制起點常有較固定的堿基順序和結(jié)構(gòu)，不同物種間保守性較高，某些位點的單堿基缺失即可使復制子失活。

功能：可以起始一個復制循環(huán)，并控制起始反應(yīng)的頻率；把完成復制的染色體分配到子細胞中去。12

E.coli的復制起點大腸桿菌復制起點oriC最小功能片段長度245bp，是含有4個9bp的反向重復和3個13bp的正向重復的特征DNA序列；這些重復序列富含A-T，有利于雙鏈解鏈；OriC中含有9-14個GATC序列，復制起始前，其中的A被Dam甲基化，則起始點被活化。1314細菌復制起點的保守性152）真核生物的復制起點酵母DNA的復制起點——自主復制序列（ARS）酵母染色體為多復制子，但不同的起點使用頻率有差別；復制起點ARS1：185bps，由A、B1、B2和B3四個元件組成，這4個元件為都是ARS1功能所必需；A元件為核心元件，該改變?nèi)魏我粋€堿基將導致ARS1失活。AnARSextendsfor~50bpandincludesaconsensussequence(A)andadditionalelements(B1-B3).

161、復制叉（replicationfork）DNA復制過程中親本雙螺旋DNA兩條單鏈解離的位點，由于雙鏈解離從而呈現(xiàn)叉狀；2、復制方向

DNA復制大多為雙向等速進行，此外還有不對稱的雙向復制（枯草桿菌）和單向復制（mt

DNA

D-環(huán)式復制）。

3、復制速度原核生物DNA復制速度較快，如E.coliDNA復制速度大約是105bp/min;真核細胞的DNA聚合酶活性低，復制速度約為500-5000bp/min；從多復制原點同時開始并雙向復制。

四、復制叉與復制方向17復制叉ReplicatedDNAisseenasareplicationeyeflankedbynonreplicatedDNA.18Repliconsmaybeunidirectionalorbidirectional,dependingonwhetheroneortworeplicationforksareformedattheorigin.復制方向1920五、復制方式的多樣性1、根據(jù)形態(tài)可分為：1）線形DNA雙鏈的復制

線性DNA雙鏈的復制叉生長方式有單一起點的單向（如腺病毒）及雙向（如T7噬菌體）和多個起始點的雙向，復制叉處呈現(xiàn)“眼”型；2）環(huán)狀DNA雙鏈的復制型大腸桿菌DNA復制中間體就是型，環(huán)狀雙鏈DNA分子復制時形成兩個方向相反的復制叉；滾環(huán)型一種單向復制方式，如X174的雙鏈環(huán)狀DNA復制型（RF）；D-環(huán)型一種單向復制的特殊形式，兩條鏈的復制起點不重合，各有一復制起點。動物線粒體DNA的復制采用的就是D-環(huán)型復制方式。21線形DNA雙鏈的復制22型復制DNA從一點開始，單向或雙向復制，產(chǎn)生一個或兩個復制叉，對一個線狀分子而言在電鏡下可見“眼狀”結(jié)構(gòu)。對于環(huán)狀分子而言“眼”的出現(xiàn)是一種“結(jié)構(gòu)”。2324X174RF的復制過程滾環(huán)式復制

25λ噬菌體DNA的滾環(huán)復制模型滾環(huán)復制：在一條鏈上產(chǎn)生一個缺口，DNA多聚酶延伸這一缺口的3’-OH端，新合成鏈替換原先的親鏈，因為增長點看上去好象在圍著環(huán)狀模板鏈生長而得名，因而叫做滾環(huán)復制。因其形狀象希臘字母，因此又叫復制。26D-環(huán)型復制雙鏈環(huán)在固定點解開進行復制，但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈上迅速合成出互補鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)（即D-環(huán)）。272、根據(jù)DNA合成的起始方式

重新起始(denovoinitiation)，子鏈的復制是重新開始，如復制叉式復制；共價延伸，子鏈是共價結(jié)合在一條親本鏈上，如滾環(huán)式復制。28六、半不連續(xù)復制SemidiscontinuousReplication1、幾個概念半不連續(xù)復制

DNA以兩條親本鏈為模板合成子鏈時，一條子鏈的合成是連續(xù)的，另一條是不連續(xù)的。前導鏈與后滯鏈（leadingandlaggingstrand）DNA雙鏈復制時，一條子鏈沿自身5‘→3’方向持續(xù)合成，即前導鏈；而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，即后滯鏈。岡崎片段(Okazakifragment)后滯鏈合成時，先以親本鏈為模板按5’→3’方向合成出許多1kb-2kb的不連續(xù)片段，被稱做岡崎片段；然后這些短片段共價聯(lián)結(jié)成一條完整的后滯鏈，后滯鏈的成長方向與其片段的合成方向相反。292、半不連續(xù)復制

Theleadingstrandissynthesizedcontinuouslywhilethelaggingstrandissynthesizeddiscontinuously.30第二節(jié)參與復制的酶和蛋白質(zhì)因子

復制體（replisome）

擔負DNA合成的多聚蛋白結(jié)構(gòu)，在復制叉處裝配。包括了DNA聚合酶和其它酶類。構(gòu)成復制體的幾種主要酶類及蛋白質(zhì)因子DNA解旋酶（DNAhelicase）DNA拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase）單鏈結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA連接酶（DNAligase）DNA引發(fā)酶（DNAprimase）RNaseH31（一）DNA解旋酶（helicase)

DNA雙鏈解旋：該酶沿單鏈DNA移動，利用ATP水解獲得能量打斷氫鍵。解旋酶是DNA復制過程中進入復制體的第一個組分，是復制過程中提供單鏈模板所必需的。E.coli的解旋酶由dnaB編碼，是由DnaB蛋白組成的六聚體,

具有5’-3’活性。DnaBDnaC解鏈方向一、超螺旋構(gòu)象變化及解鏈有關(guān)的酶和蛋白32DNA雙鏈解開需要有改變DNA拓撲結(jié)構(gòu)的酶；解鏈產(chǎn)生扭曲張力，去除和解離復制和重組中產(chǎn)生的節(jié)和環(huán)。兩種功能類型：I型拓撲異構(gòu)酶只剪切一條鏈，作用于含缺口的底物；II型拓撲異構(gòu)酶同時切開兩條鏈，可作用于共價閉環(huán)鏈。（二）DNA拓撲異構(gòu)酶331、DNA拓撲異構(gòu)酶I（TopoisomeraseI）1）特點對超螺旋DNA雙鏈底物，僅切開一條鏈；配對鏈通過切口及斷端再連接而改變DNA拓撲態(tài)，一步反應(yīng)可改變鏈環(huán)數(shù)1;不需要能量，不能除去正超螺旋等需能量的反應(yīng)，對正超螺旋不敏感；主要在DNA損傷修復中起作用。

34E.coli的TopoI結(jié)合雙鏈DNA，并切割一條鏈；斷裂的DNA的5’-P端與酶的一條臂的Tyr殘基-OH基共價連接，3’-OH端與酶的另一臂共價連接；一條臂跨過未被切斷的單鏈后，將5’-P與3’-OH重新連接，使DNA雙螺旋減少一圈。E.coli的TopoI（ω蛋白）的作用過程351）特點同時切割超螺旋DNA的雙鏈，并重新連接，一次反應(yīng)能改變兩個連環(huán)數(shù)；需要輔助因子ATP能量，能除去正超螺旋等需能量的反應(yīng)；主要在DNA復制中起作用。2）TopoII可分為兩個亞類一亞類能引入負超螺旋，如E.coli旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）另一亞類是使超螺旋DNA（無論正負）變?yōu)闆]有超螺旋的松弛DNA。2、DNA拓撲異構(gòu)酶II（TopoisomeraseII）36TopoⅡ:對雙鏈DNA同時切斷，另一段DNA通過切口，然后斷端按原位連接而改變DNA的拓撲態(tài)，一般反應(yīng)可改變連環(huán)數(shù)2。37E.coli旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）結(jié)構(gòu)特征由兩個A亞基和兩個B亞基構(gòu)成的四聚體；A亞基具有切割雙鏈DNA，進行拓撲結(jié)構(gòu)改變和重新連接的功能；B亞基具有ATPase酶活性。38（三）單鏈結(jié)合蛋白（SSB）1、SSB是缺乏酶活性的復制輔助蛋白，是復制體其它酶有效活性所必需的。SSB對單鏈DNA有高親和性，對雙鏈沒有親和力。2、功能穩(wěn)定DNA單鏈區(qū)域：穩(wěn)定熔解起點、維持螺旋酶活性、從DNA模板上去除二級結(jié)構(gòu)、抑制核酸酶活性；與復制體不同組分相互作用以促進這些組分的活性，例如與引發(fā)酶或引發(fā)體的組分相互作用促進其特定的引發(fā)活性。3940（一）DNA聚合酶

1、DNA聚合酶

以DNA為模板合成DNA新鏈時需要的酶，DNA聚合酶從5‘到3’把核苷酸連續(xù)加在延伸DNA的游離3‘羥基上。2、DNA聚合酶的特性

1）底物必須是dNTP；

2）以DNA為模板，鏈延伸功能，不能從頭開始合成；

3）合成方向只能是5‘→3’。二、復制延伸和終止有關(guān)的酶和蛋白413、DNA聚合酶的種類——大腸桿菌42大腸桿菌有多種DNA聚合酶，其中只有聚合酶III是DNA復制必需，作用是隨復制叉移動延長新生鏈；聚合酶I主要是添補后滯鏈的間隙及負責損傷DNA的修復等功能；DNA聚合酶I具有5’→3’方向核酸外切酶活性，能切除引物RNA。43

DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III結(jié)構(gòu)分子量（道爾頓）構(gòu)成（亞基數(shù)）數(shù)量/細胞103,000140088,0004不清楚>900,00010異多聚體10-20酶活性5’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性5’-3’外切酶活性++++++（可切單鏈）突變突變位點突變表現(xiàn)型polA修復缺陷polB修復缺陷polC,dnaN,dna,dnaQ,dnaT復制受阻大腸桿菌的三種主要DNA聚合酶

444、DNA聚合酶的種類——真核生物真核生物中發(fā)現(xiàn)5種DNA聚合酶，、、和定位于核內(nèi)，而位于線粒體；在DNA合成期水平升高，主要負責復制引發(fā)和后滯鏈部分序列的合成；是DNA雙鏈合成的主要聚合酶，在合成起始后存在聚合酶/的轉(zhuǎn)換（switch）；DNA聚合酶沒有3’→5’核酸外切酶活性；而和有校正閱讀活性，保證復制忠實性。45哺乳動物的DNA聚合酶

DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶位置功能細胞核引發(fā)和起始復制細胞核鏈延伸線粒體線粒體復制細胞核后隨鏈完成修復分子量(D)亞基數(shù)目300,0004170-230,0001180-300,000140,0001雙脫氧甲基嘧啶蚜棲菌素無影響抑制弱強抑制無影響抑制無影響465、DNA聚合酶的功能1）DNA合成所必需

DNA合成活性是所有DNA聚合酶的基本功能，在其催化下作為合成前體的dNTP可依照模板連接到新生鏈的3‘-OH端。

47DNA合成的兩種基本類型：DNA復制和修復。Semi-conservativereplicationsynthesizestwonewstrandsofDNA.

RepairsynthesisreplacesadamagedstrandofDNA.

482）多方面的核酸酶活性DNA聚合酶I是一“多能”酶，由polA編碼，可水解成兩部分：較大的部分（68KD）叫Klenow片段，具聚合活性和3‘→5’外切核酸酶活性；小片段（34KD）具5‘→3’外切核酸酶活性，外切活性可切除達10個核苷酸的小片段，利用這一功能可實現(xiàn)缺口平移（nicktranslation）。

利用DNA聚合酶I可進行體外的DNA放射性標記。

聚合酶III是一大的酶復合體，含多個亞基，每個亞基有不同酶活。亞基具有合成活性；而亞基具有3‘→5’核酸外切校正活性，保證復制的準確性。49503’-5’外切功能5’-3’外切功能Klenow片段的晶體結(jié)構(gòu)51缺口翻譯（nicktranslation）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ可利用雙螺旋DNA鏈上由一個磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生的缺刻(nick)，將一條單鏈降解并從缺刻的3’-OH端合成一條新鏈替代降解的同源鏈，這一過程稱缺口平移。523）保證DNA復制的準確性校正(proofreading)

糾正蛋白質(zhì)或核酸合成發(fā)生錯誤的機制，包括對已加入到合成鏈上的單位進行核查，對錯配堿基依靠聚合酶3’→5’核酸外切活性來校正。例如，復制中每添加一堿基發(fā)生錯配的幾率約103，而實際錯配率約108-1010。DNA聚合酶在兩個階段控制堿基配對的特異性：

合成前錯誤控制：通過對不同堿基特性的特異性識別、核對所引入的堿基是否與模板堿基配對；

合成后校正：檢查生長鏈末端堿基配對情況，通過外切功能除去錯配堿基。53細菌DNA聚合酶的校正功能

Inthechainelongationstep,aprecursornucleotideentersthepositionattheendofthegrowingchain.Abondisformed.Theenzymemovesonebasepairfurther,readyforthenextprecursornucleotidetoenter.Ifamistakehasbeenmade,theenzymemovesbackward,excisingthelastbasethatwasadded,andcreatingasiteforareplacementprecursornucleotidetoenter.

546、DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合于三個結(jié)構(gòu)域所組成的大溝上。“手掌”結(jié)構(gòu)域：具有高度保守的模體，提供催化活性位點。“手指”結(jié)構(gòu)域：將模板正確結(jié)合到活性位點。“拇指”結(jié)構(gòu)域：行使前進能力。N結(jié)構(gòu)域：核酸酶活性。557、DNA聚合酶III全酶裝配模型、、亞基組成核心酶，是催化核心;亞基是進行性因子，以二聚體形式形成一個可以沿DNA滑動的“滑動夾”，使核心酶附著于模板;

復合物控制了酶的進行性，即亞基在DNA上的定位和解離都需要復合物，亞基只與一個單體結(jié)合.亞基連接核心酶形成二聚化;56（二）DNA連接酶專門催化“切刻”——即二酯鍵的5‘-磷酸基與3’-羥基的連接，要求各自的堿基處于配對狀態(tài)。連接所需的能量來自NAD+（細菌）或ATP（真核細胞、古細菌）。連接酶在DNA復制、重組、修復中均有重要作用。

57（三）DNA引發(fā)酶在DNA合成過程中合成RNA引物。功能：

1）在起點處起始先導鏈的合成(1次)；

2）協(xié)助岡崎片段的反復起始。引發(fā)體(primesome)：由引發(fā)酶和解旋酶形成的功能復合物。引發(fā)酶的有效引發(fā)活性依賴于解旋酶。不同的復制子對引發(fā)要求不同，有的復制起點可被引發(fā)酶直接識別，沒有引發(fā)體，如噬菌體G4；而型復制子的引發(fā)體含有多個蛋白，結(jié)構(gòu)復雜。58復制體各組分的功能復制體成分在復制中的功能DNA聚合酶DNA連接酶單鏈結(jié)合蛋白DNA解旋酶DNA拓撲異構(gòu)酶引發(fā)酶RNaseH多種形式，分別負責先導鏈的合成，后滯鏈的合成及后滯鏈的修復連接修復的后滯鏈片段穩(wěn)定復制叉的單鏈區(qū)域使復制叉前面的DNA解鏈釋放因解旋酶的活性而造成的扭曲鏈，復制后使松弛的DNA雙鏈恢復負超螺旋；RNA引物的合成切除RNA引物59細菌和真核生物復制體性質(zhì)比較復制體性質(zhì)細菌真核生物復制起點延伸速度岡崎片段長度引發(fā)策略復制聚合酶拓撲學單個100kbpmin-11-2kbp引發(fā)酶產(chǎn)生引物，由polIII延伸不同進行性單體的異源二聚體松弛和卷曲間存在平衡，負超螺旋很多2kbpmin-1100-200bp由pol引發(fā)并起始合成，由pol延伸完成每條鏈有不同的酶，有不同的進行性濃縮在核小體中的負超螺旋6061一、DNA復制的起始與引發(fā)

（一）引發(fā)的一般原則與策略1、DNA單鏈狀態(tài)是復制所必需的；2、DNA復制的起始需要引發(fā)。一般情況下，

DNA引發(fā)酶合成RNA引物用于DNA復制引發(fā)；3、原核生物中，引物直接由DNA聚合酶III延伸；4、真核生物中，DNA聚合酶在每個引物上加上4-5個脫氧核苷酸[起始DNA(initiatorDNA)]，DNA末端由DNA聚合酶δ延伸。5、先導鏈的引發(fā)有一系列不同的策略；而由DNA引發(fā)酶合成的短RNA引物是后滯鏈合成的通用引發(fā)方式。第三節(jié)原核生物的復制機理62先導鏈引發(fā)的不同機制引發(fā)機制細節(jié)舉例RNA引物發(fā)夾引發(fā)內(nèi)切引發(fā)入侵引發(fā)末端蛋白引發(fā)寡核苷酸引發(fā)DNA引發(fā)酶合成短新生寡聚核苷酸RNA聚合酶合成特殊轉(zhuǎn)錄本預(yù)先形成的tRNA引物的退火單鏈DNA反轉(zhuǎn)末端重復序列形成發(fā)夾內(nèi)切酶在雙鏈DNA產(chǎn)生切口暴露3‘-OH3‘末端通過同源重組導入部分線形DNA由末端核酸結(jié)合蛋白引發(fā)體外延伸時寡核苷酸退火到模板上細胞DNA線粒體,ColE、逆轉(zhuǎn)錄病毒皰疹病毒滾環(huán)復制T4晚期復制腺病毒PCR,cDNA合成63引物1、參與引物合成的酶引發(fā)酶：細菌、部分噬菌體DNA聚合酶：真核生物、部分噬菌體；RNA聚合酶：M13噬菌體；2、引物的長度X174和E.coli前導鏈：2-5個堿基；真核生物和岡崎片斷：10個堿基；M13和G4：20-30個堿基。64引發(fā)的不同形式65（二）噬菌體DNA復制的引發(fā)1、單鏈噬菌體DNA復制的不同引發(fā)方式G4噬菌體不用RNA聚合酶，而由dnaG編碼的蛋白負責引發(fā)，即引發(fā)酶；M13噬菌體以RNA聚合酶來合成引物；X174復制RNA引物的合成需更多蛋白因子，這一蛋白復合物稱引發(fā)體（primosomecomplex)；X174是多位點引發(fā)，而另兩種噬菌體是單一位點。2、引發(fā)酶

引發(fā)酶是一種特殊的RNA聚合酶，由dnaG編碼，比一般的E.coliRNA聚合酶小，分子量為65kD。66單鏈噬菌體DNA復制中RNA引發(fā)的三種機制673、噬菌體的復制起始復制原點大約是350bps，包括：4個高度保守的19bp組成的正向ori重復序列，40bp組成的富含A/T序列，28bp的回文序列；PROR發(fā)動的轉(zhuǎn)錄是DNA復制必需的，一方面使復制原點解鏈，另一方面轉(zhuǎn)錄了基因O和基因P；O蛋白的結(jié)合位點是四個ori重復序列，隨著O蛋白聚集體的形成，P蛋白和DnaB解旋酶以P-DnaB復合的形成加入，形成oriλ-O-P-DnaB復合物。P蛋白能抑制DnaB螺旋酶的ATP酶活性，因此P蛋白失活或者從復合物中脫落的情況下，DNA復制才能起始。68E.coli

復制起始有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)（三）大腸桿菌雙鏈復制的起始69E.Coli復制起始大腸桿菌復制起點oriC最小序列245bp，含有4個9bp和3個13bp的特征DNA序列；9bp是DnaA結(jié)合位點，20-40個DnaA單體順序結(jié)合oriC形成中央核心；3個13bp重復區(qū)段是AT豐富區(qū)，在DnaA蛋白作用下熔解；70形成起始復合物

DnaA與復制原點的4個9聚體DNA序列結(jié)合，不需要ATP。形成開放復合物

20-40個DnaA聚集于此，形成開放復合物，DNA在13聚體處熔解，需要ATP和控制DNA結(jié)構(gòu)的HU蛋白。形成預(yù)引發(fā)體

DnaB解旋酶在DnaC的幫助下定位，DnaC從復合物中釋放。形成引發(fā)體

DNA被DnaB解鏈，形成雙向復制叉，引發(fā)酶加入，合成引物。DNA合成延伸

征集拓撲異構(gòu)酶和SSB，在polIII作用下延伸開始。71電鏡下復制起點結(jié)構(gòu)

OriC形成的復合物。上面顯示了復制前的預(yù)引發(fā)體復合物，下面顯示起始復制1分鐘后復制泡的復合物，兩種復合物均可通過DnaB抗體作用觀察到。

72（四）后滯鏈起始機制

復制叉前進后，在引發(fā)體后面產(chǎn)生單鏈區(qū)，單鏈區(qū)隨之被SSB覆蓋，后滯鏈處于適于做模板狀態(tài)，引發(fā)體產(chǎn)生后滯鏈岡崎片段的RNA引物，因此引發(fā)體移動方向與復制叉一致但與岡崎片段延伸方向相反。

73二、復制延伸過程1.DNA復制延伸的5個階段雙鏈DNA不斷解螺旋；前導鏈DNA的合成；后滯鏈不斷合成新的RNA引物；合成岡崎片段；RNA引物去除，岡崎片段連接。74752、雙鏈復制回環(huán)模型1）不對稱的復制體（replisome）DNA聚合酶III是不對稱二聚體，有兩個DNA合成的催化中心；在復制叉處，DNA聚合酶III和引發(fā)體以及其他復制蛋白構(gòu)成復制復合體；每個復制中心含有兩個亞基；亞基負責將DNA聚合酶III結(jié)合為二聚體。全酶是不對稱的，只有一個復合物。76DNA復制延伸時，前導鏈和后滯鏈的合成各利用DNA聚合酶III的一個催化中心；后滯鏈的模板圍繞其中一個催化中心折疊成環(huán)狀，使后滯鏈方向顛倒，但生化反應(yīng)方向不變，使前導鏈和后滯鏈同時合成。2）雙鏈復制回環(huán)77環(huán)上RNA引發(fā)酶形成引物，DNA聚合酶隨后延伸，DNA聚合酶沿復制叉移動，復制片段延長，環(huán)變大，直至遇到下一個岡崎片段，釋放環(huán)。模型的關(guān)鍵在于前導鏈與后滯鏈合成的進行性及DNA聚合酶的不對稱性。78先導鏈與后滯鏈同時復制模型79三、復制的終止1.大腸桿菌的復制有固定的終點終止子(terminator)：染色體和質(zhì)粒DNA中復制終止的特定序列；2個終止區(qū)域：每個區(qū)域含有若干個終止子(terE,D,A和terC,B)，每個終止區(qū)可終止一個方向復制叉運動。2.多數(shù)環(huán)狀DNA復制沒有固定終點，僅是兩個生長點的簡單碰撞。3.環(huán)狀分子復制后產(chǎn)生連環(huán)分子(catenane)，在拓撲異構(gòu)酶的催化下將連環(huán)分子分離。（一）環(huán)狀DNA復制的終止80大腸桿菌復制的終止終止子帶有約23bp的短一致序列（consensussequence）tus基因編碼蛋白Tus可識別該序列并與之結(jié)合抑制復制叉的前進，ter-Tus阻斷復制的功能有方向依賴性；ter-Tus復合物可能通過抑制解旋酶來實行復制終止。8182（二）線狀DNA復制的完成

1、線形DNA復制存在的問題——5’末端“隱縮”832、對策線狀DNA環(huán)化（噬菌體）或連成多聚體（T7噬菌體）；DNA形成特殊結(jié)構(gòu)，如末端產(chǎn)生發(fā)夾，不產(chǎn)生自由末端；還可以形成十字交叉結(jié)構(gòu)，如草履蟲線狀線粒體DNA復制；專一性蛋白與末端作用保證其引發(fā)，腺病毒、φX29噬菌體等線性病毒核酸有蛋白與5’末端堿基共價相連。可變末端，真核生物DNA末端有多拷貝的短重復單位，拷貝數(shù)可變化，可以加上或去掉。841）T7噬菌體線性DNA末端復制末端冗余：T7噬菌體分子兩端有重復的序列；后滯鏈最后一個岡崎片段的RNA引物水解后，在子代5’端各缺少一段核苷酸——“隱縮”現(xiàn)象；復制后兩個子代分子單鏈末端互補、退火形成二聚體；內(nèi)切核酸酶作用，產(chǎn)生供延伸的3’-OH端和5’突出末端。在聚合酶作用下形成正常的兩個子代分子。852）腺病毒DNA的復制復制起始86腺病毒DNA復制過程腺病毒兩端有反向末端重復序列；腺病毒兩端各有一復制原點；起始復合物：當腺病毒單鏈DNA結(jié)合蛋白和ATP存在時，末端蛋白TP催化末端解鏈；在腺病毒DNA聚合酶催化下dCTP與pTP以磷酸二酯鍵共價相連；C與模板3‘端的G以氫鍵相配對；通過鏈置換首先完成一條鏈的合成；被置換出的鏈形成“平底鍋”結(jié)構(gòu)，再以同樣的方式復制其互補鏈。87第四節(jié)病毒基因組復制的多樣性一、單鏈RNA病毒的復制1、類型：單鏈正RNA，即()RNA病毒單鏈負RNA，即()RNA病毒2、單鏈RNA病毒的復制酶

依賴于RNA的RNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶883、單鏈RNA病毒的復制方式1）依賴于RNA的RNA聚合酶作用的復制892）依賴于RNA的DNA聚合酶作用的復制1970年Temin和Migufan等發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄酶具有RNA指導的DNA聚合酶活性，同時具有DNA指導的DNA聚合酶活性，其引物是tRNA；作用過程：1）逆轉(zhuǎn)錄酶以病毒單鏈RNA為模板，在引物3’-OH端合成互補的DNA鏈，形成DNA-RNA雜交分子；2）RNaseH降解雜和分子中的RNA，剩下一條DNA鏈；3）在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，從DNA回折的3’-OH端延伸出互補的DNA鏈，而形成雙鏈DNA，稱cDNA。4）再從cDNA合成子代病毒RNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒形成的雙鏈cDNA?？烧先胨拗鳎l(fā)癌變，所以逆轉(zhuǎn)錄病毒常常有致癌作用。

逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）9091HIV復制HIV進入細胞，以tRNA為引物，逆轉(zhuǎn)錄酶合成5’端PB/U5/R區(qū)域DNA；RNaseH切除DNA/RNA雙鏈中的模板RNA；模板轉(zhuǎn)換，新生成的DNA與HIV基因組3’端配對，在RT的作用下合成()DNA；RNaseH水解除env區(qū)外的大部分()RNA，剩余的env區(qū)小段RNA作為引物合成()DNA；5’端tRNA和部分()RNA移去，第二次跳躍，RT進行DNA復制，產(chǎn)生雙鏈DNA；雙鏈DNA末端形成U3-R-U5的長LTR結(jié)構(gòu)。92二、雙鏈RNA病毒的復制1、基因組特點：雙鏈RNA病毒基因組是不連續(xù)，不同的雙鏈RNA是分開的。呼腸弧病毒有10個片段，輪狀病毒有11個片段。2、轉(zhuǎn)錄：雙鏈RNA病毒的負鏈RNA合成mRNA，然后翻譯成各種蛋白質(zhì)；3、復制：以基因組負鏈RNA為模板合成許多正鏈RNA，再在RNA聚合酶的作用下合成雙鏈RNA。93三、雙鏈DNA病毒的復制941、病毒類型：1）從攜帶信息來區(qū)分：基因組為()DNA和基因組為()DNA；2）從形狀來區(qū)分：環(huán)狀和線性，環(huán)狀如M13、G4、

174

；四、單鏈DNA病毒的復制952、單鏈環(huán)狀DNA的復制第一階段以親本鏈（＋鏈）為模板合成互補的環(huán)狀負鏈，形成閉合環(huán)狀的復制形（RF1）。第二階段以滾環(huán)復制（loopedrollingcirclereplication）產(chǎn)生多個子代RF；第三階段以RF的負鏈為模板進行滾環(huán)復制產(chǎn)生多拷貝正鏈單環(huán)。96１）174的復制過程Φ174RNA引物的合成需多個蛋白因子，這一蛋白復合物稱引發(fā)體(primosome)；Φ174有一個預(yù)引發(fā)位點，而引發(fā)位點有許多個；引發(fā)體在單鏈DNA上是沿著模板5‘-3’方向移動，同DNA合成方向相反；當引發(fā)體發(fā)現(xiàn)引發(fā)位點時就可以合成引物RNA，因此所復制的負鏈是由一系列岡崎片段組成，因此新生的DNA鏈是后滯鏈。負鏈合成97RF-I復制型通過滾環(huán)復制合成正鏈多拷貝A蛋白結(jié)合其識別位點并誘導富含A/T序列熔解；A蛋白在一特定位點切斷磷酸二酯鍵，并與端裂的5‘核苷酸共價連接；在Rep、SSB和polIII協(xié)同作用下，(+)鏈的3’-OH不斷延伸，5’端不斷被置換；復制到起始原點序列時，A蛋白在此處將鏈切斷，并環(huán)化。982）M13噬菌體基因組除59bp序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)外，其余均被SSB覆蓋，發(fā)夾結(jié)構(gòu)是起始信號；寄主RNA聚合酶在此結(jié)構(gòu)前起始RNA引物合成（20-30堿基），發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開；SSB結(jié)合到發(fā)夾結(jié)構(gòu)中未形成雜交鏈的部分，終止發(fā)夾頂端的轉(zhuǎn)錄；RNA引物被DNA多聚酶Ⅲ延伸，至RNA引物的另一端；DNA聚合酶Ⅰ的外切活性切除RNA，并填補空隙；缺刻最終由連接酶接上。993、單鏈線性DNA的復制——細小病毒細小病毒反義DNA鏈的合成需借助于宿主細胞的RNA聚合酶和DNA聚合酶；細小病毒(+)DNA基因組兩端有可通過折疊互補形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列；3’端發(fā)夾可作為DNA復制的引物，合成互補鏈，經(jīng)連接酶連接后形成環(huán)狀DNA；發(fā)夾結(jié)構(gòu)被特異性限制性內(nèi)切酶切割后，得到線性雙鏈DNA；雙鏈階段，反義鏈既可作為轉(zhuǎn)錄的末板，也可作為復制有義鏈的模板。100第五節(jié)真核生物的DNA復制

1、DNA甲基化：胞嘧啶C5位甲基化促使染色體結(jié)構(gòu)解開，有利于復制酶和蛋白因子的結(jié)合；2、有多個復制起點，復制起點不是同時開啟；復制起點也是變化的，發(fā)育活化的細胞有更多的復制起點；3、真核生物染色體在全部復制完成前，各復制起點不能進行新一輪復制；4、引發(fā)酶是DNA聚合酶的一個亞基；復制延伸階段發(fā)生DNA聚合酶/轉(zhuǎn)換。（一）真核生物DNA復制的特點101102（二）真核生物DNA復制酶和蛋白因子βγ1031、真核生物的DNA聚合酶和引發(fā)酶5’-3’104DNA聚合酶/引發(fā)酶負責兩條鏈復制的引發(fā)；既具有聚合酶活性，也具引發(fā)酶活性，二者是偶連的；具有5’→3’聚合活性，無3’→5’外切酶活性，其功能RNA引物和起始DNA（iDNA）合成。105起始DNA（initiatorDNA,iDNA）

poly-引發(fā)酶在復制叉上首先合成RNA引物，長度8—12堿基，然后DNA聚合酶活性將RNA引物繼續(xù)延伸，產(chǎn)生短的DNA序列，即起始DNA。

SV40復制起始研究顯示poly-引發(fā)酶合成的引物RNA-iDNA長度約40nt，其中5’端RNA引物約10nt。DNA聚合酶轉(zhuǎn)換

poly-引發(fā)酶缺乏持續(xù)合成DNA鏈的能力而離開模板DNA。其他DNA聚合酶利用RNA-iDNA引物，分別合成前導鏈和后滯鏈。106DNA聚合酶poly負責先導鏈合成和后滯鏈的持續(xù)合成；poly為二聚體，既有5’→3’聚合活性也有3’→5’外切酶活性，有校對功能；poly功能需要分裂細胞核抗原PCNA，PCNA可促進poly與模板-引物的相互作用。DNA聚合酶poly的結(jié)構(gòu)與類似，酶活性也相似，都具有高度的持續(xù)合成能力；可能是負責復制后的修復或在由于復雜的拓撲結(jié)構(gòu)造成的復制暫停位點起始復制。1072復制蛋白A（replicationproteinA,RPA）單鏈結(jié)合蛋白，RPA是DNA復制必需的；促進DNA進一步解旋，激活poly引發(fā)酶活性，是組裝引發(fā)復合體所必需的；RPA為三聚體，但單獨亞基不具活性。3復制因子C（replicationfactorC,RFC）RFC具有依賴于DNA的ATPase活性，其活性被PCNA進一步激活；RFC的主要作用是促使PCNA環(huán)形分子結(jié)合模板-引物鏈，或者使PCNA結(jié)合在DNA雙螺旋DNA的切口；RFC由5個亞基組成。1084分裂細胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)PCNA是pol的輔助蛋白，其功能是pol的進行性因子，使pol獲得持續(xù)合成的能力；PCNA本身沒有結(jié)合DNA的能力，在依賴于ATP的RFC的作用下，PCNA三聚體裝載于DNA；PCNA是同源三聚體，可形成環(huán)形結(jié)構(gòu)與雙螺旋DNA緊密結(jié)合5

DNA解鏈酶解鏈酶在復制叉上沿著一條DNA鏈單向移動，使雙鏈DNA分開成為模板；SV40中DNA解鏈酶是大T抗原；真核細胞染色體DNA復制的解鏈酶尚不清楚。109（三）真核生物DNA的復制過程1、DNA聚合酶/的轉(zhuǎn)換特異蛋白識別復制原點并結(jié)合，解旋酶促使原點解鏈；RPA結(jié)合維持單鏈狀態(tài)并使解鏈區(qū)域向左右轉(zhuǎn)移；poly-引發(fā)酶在RPA覆蓋的單鏈DNA模板上合成RNA-iDNA引物；RFC結(jié)合于iDNA3’端，將PCNA裝到DNA上，組裝poly復合物，由其取代poly，發(fā)生聚合酶轉(zhuǎn)換。1102、岡崎片段的成熟引物切除：RNaseH1/FEN1可利用前者的內(nèi)切酶活性切割岡崎片段5’端RNA片段，留下的RNA-iDNA連接點旁的核糖核苷酸由后者的外切酶活性切除；間隙填補由poly或負責；片段的連接則由DNA連接酶I負責；參與岡崎片段成熟的蛋白均結(jié)合PCNA，受其協(xié)調(diào)；111研究表明前導鏈和后滯鏈的合成都需要poly-引發(fā)酶和poly，都會發(fā)生聚合酶的轉(zhuǎn)換；轉(zhuǎn)換出現(xiàn)在前導鏈的引發(fā)階段，而在后滯鏈中發(fā)生于每個岡崎片段的合成之初；前導鏈和后滯鏈的合成在酶學上十分接近。112113Pol1141、端粒（telomere)—結(jié)構(gòu)與功能保守的亞細胞結(jié)構(gòu)1）端粒是真核生物染色體末端的蛋白質(zhì)-DNA結(jié)構(gòu)，其功能是完成染色體末端復制，可防止染色體融合、重組和降解。（四）真核生物DNA的末端復制1152）端粒DNA：由短而數(shù)目精確的串聯(lián)簡單重復序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，3’突出于5’，維持染色體的穩(wěn)定性。人染色體端粒長度約15kb，由上千個TTAGGG組成，3’端富含GT。正常細胞中端粒DNA隨著細胞的有絲分裂會逐漸縮短，而永生細胞中端粒長度是穩(wěn)定的。1163）端粒結(jié)合蛋白酵母的端粒結(jié)合蛋白已分離到Raplp和ku兩類；Raplp結(jié)合于端粒DNA，能限制端粒介導的延伸，當端粒長度達到一定閾值時，會負調(diào)控端粒酶活性，使端?？s短。人的端粒相關(guān)蛋白TRF1,TRF2,tankyrase,UP1,TINF2TRF1的功能與Raplp相似，可以導致端粒變短；TRF2則可以防止染色體末端相互融合。1172、端粒酶（telomerase）1）端粒酶是一種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，能催化合成端區(qū)重復序列。端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)組成，是一種核糖核蛋白。2）RNA：單鏈，提供AAUCCC（哺乳動物）模板，指導短重復序列（TTAGGG）合成；3）蛋白質(zhì)：提供催化活性，人的端粒酶蛋白組分稱為“人端粒反轉(zhuǎn)錄酶”（hTERT）。118119端粒酶的結(jié)構(gòu)RNA亞基：二級結(jié)構(gòu)有4個保守雙螺旋，雙螺旋I區(qū)最保守，其余三個雙螺旋是莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域。蛋白質(zhì)亞基：是端粒酶的催化亞基，與RNA一起構(gòu)成核心酶。人的該亞基長度為1132個AA,有7個與病毒逆轉(zhuǎn)錄酶相同的結(jié)構(gòu)域。1204）端粒酶活性一般存在于：生殖細胞，包括胚胎干細胞；癌細胞；單細胞真核生物，如四膜蟲；有時在細胞循環(huán)的S期，即染色體合成時期端粒酶也有短暫表達。1211223端粒酶的復制機制123端粒酶RNA模板與端粒DNA3’端雜交，以其RNA內(nèi)的3個堿基AAC為模板，在端粒DNA末端加TTG；端粒酶轉(zhuǎn)位到端粒的新3‘端，模板RNA的AAC序列與端粒新合成的TTG配對；端粒酶利用RNA為模板，再加6個堿基GGGTTG到端粒3’端；通過易位與延伸，反復地將重復片段加到富含G的突出的3‘端上；當富含G鏈達到一定長度，引發(fā)酶能合成RNA引物，與端粒富含G的鏈的3‘端互補；DNA聚合酶延伸合成DNA；RNA引物被去除，留下3’突出端。124端粒復制The