細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化培訓(xùn)課件

細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化一、培養(yǎng)基的種類和選擇

(一)基本條件1.合格的細(xì)菌實驗室2.合格的無菌實驗室3.基本設(shè)備和器具2細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化(二)培養(yǎng)基培養(yǎng)基(culturemedium)是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。用途：①可用于細(xì)菌的分離純化、傳代和菌種保存②可用于研究細(xì)菌的生理生化特性③是對病原菌分離鑒定的主要環(huán)節(jié)和必不可少的手段3細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化1.培養(yǎng)基的組成成分：⑴營養(yǎng)物質(zhì)：水、蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇類、血液、無機(jī)鹽、雞蛋和動物血清、生長因子（Vit、aa、嘌呤、嘧啶等）。4細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化⑵凝固物質(zhì)：

最常用的為瓊脂(agar)，它是從石花菜中提出來的一種半乳糖膠，100℃溶解，40℃凝固，可利用瓊脂來改變培養(yǎng)基的物理性狀(固體或半固體)，它是理想的固體培養(yǎng)基的賦形劑，其本身不被細(xì)菌分解利用，也無營養(yǎng)作用。5細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化⑶抑菌劑和指示劑：不是細(xì)菌生長繁殖的必需物質(zhì)，是制備細(xì)菌的選擇、鑒別培養(yǎng)基和判斷結(jié)果的需要。

常用的抑菌劑有：膽鹽、煌綠、亞硫酸鈉、亞硒酸鈉及一些染料和某些抗生素等。

常用的指示劑有：酚紅、中性紅、甲基紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)、中國蘭等酸堿指示劑，美蘭為常用的氧化還原指示劑。6細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化2.培養(yǎng)基的分類液體培養(yǎng)基：牛肉湯

(牛肉浸液+1%蛋白胨

+0.5%NaClpH7.4)半固體培養(yǎng)基：加0.2~0.5%agar固體培養(yǎng)基：營養(yǎng)物+2%agar

按物理性狀7細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：是其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)，如普通肉湯、

普通瓊脂平板、斜面、高層營養(yǎng)培養(yǎng)基：BAP、羅-琴培養(yǎng)基、呂氏血清斜面選擇培養(yǎng)基：SS平板、BS平板、Mac平板等鑒別培養(yǎng)基：糖發(fā)酵管、MIU、KIA、TSI等特殊培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)基、高滲培養(yǎng)基等按用途8細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化3.常用培養(yǎng)基的制備⑴肉膏湯的制備：

0.3%牛肉浸膏+1%蛋白胨+0.5%NaCl加熱溶解，調(diào)pH7.4~7.6，分裝，121℃，20分鐘高壓滅菌冷后待用?？捎糜跇?biāo)本和細(xì)菌的增菌。⑵普通瓊脂平板、斜面、高層：

肉膏湯+2%agar，加熱溶解，121℃，20分鐘高壓滅菌冷至50℃

平皿→普通瓊脂平板：分離純培養(yǎng)和藥敏傾倒

試管(斜放)→普通瓊脂斜面：增菌、保存細(xì)菌試管(直立)→普通瓊脂高層：備用

9細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化⑶血瓊脂平板：普通瓊脂平板營養(yǎng)物質(zhì)滅菌冷至50℃+5%~10%脫纖維SRbc或RRbc，搖勻，傾倒無菌平皿，冷凝后即成血平板。常用于營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌的分離純培養(yǎng)和藥敏。⑷半固體肉湯：牛肉湯(牛肉浸膏湯)+0.2%~0.5%agar→加熱溶化→分裝→高壓滅菌→冷卻即成。常用于保存菌種和觀察細(xì)菌的動力。10細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化4.選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基：根據(jù)臨床標(biāo)本中細(xì)菌的需要，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。11細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化二、分離培養(yǎng)（一）細(xì)菌的分離1.平板劃線分離法——分離純培養(yǎng)

①分區(qū)劃線

②連續(xù)劃線2.斜面接種法連續(xù)蜿蜒劃線，從斜面底部至斜面頂端3.液體接種法在試管內(nèi)壁與液面交接處管壁上研磨，使細(xì)菌混于液體中。4.半固體接種法穿刺接種法12細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化傾注平板法取一定量的稀釋標(biāo)本加入無菌平皿，再加入冷至45℃左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝后倒置培養(yǎng)。6.涂布法把稀釋定量被檢菌液均勻涂布于瓊脂平板表面。7.定量接種環(huán)法把定量接種環(huán)沾取菌液均勻涂布于瓊脂平板表面。13細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化(二)細(xì)菌的培養(yǎng)方法

根據(jù)臨床初步診斷及待檢細(xì)菌的種類，可選用不同環(huán)境條件進(jìn)行培養(yǎng)，常用培養(yǎng)方法有：1.需氧培養(yǎng)：適用于需氧菌和兼性厭氧菌，在有氧環(huán)境下35℃孵育18~24h。2.CO2培養(yǎng)：適用5%~10%CO2環(huán)境才生長良好的細(xì)菌，如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布魯菌的首次分離培養(yǎng)。供給CO2的方法有：CO2培養(yǎng)箱、燭缸法、化學(xué)法(每升容積0.4gNaHCO3+0.35ml濃HCl)。3.厭氧培養(yǎng)法：適用于厭氧菌的分離培養(yǎng)，常用的方法有厭氧罐法、氣袋法和厭氧手套箱法等。14細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化15細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化(三)細(xì)菌的生長情況在平板上——呈菌落(colony)生長，常用于細(xì)菌分離純培養(yǎng)在斜面上——呈菌苔或菌落生長，可用于增菌或保存菌種。半固體中——呈遷徙生長(有動力)?？捎糜谟^察動力和保種。在液體中——呈表面生長，均勻混濁生長和沉淀生長?？捎糜谠鼍丸b別細(xì)菌。16細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化思考題細(xì)菌有哪些分離培養(yǎng)與接種技術(shù)？簡述細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長情況及實際意義？17細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化三、生化反應(yīng)

由于不同種類細(xì)菌的酶系統(tǒng)不同，故其新陳代謝過程中的合成代謝產(chǎn)物（毒素）與分解代謝產(chǎn)物（生化反應(yīng)）也不一樣，借此可鑒別細(xì)菌。

生化反應(yīng)：不同菌體內(nèi)具有不同的獨(dú)特酶系統(tǒng)，故對各底物(糖、蛋白等)的分解產(chǎn)物也不一樣，用此方法來鑒別細(xì)菌叫生化反應(yīng)。18細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化（一）碳水化合物的代謝試驗1.糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗

產(chǎn)酸(+)：丙酮酸、乳酸、甲酸等原理：細(xì)菌糖類

產(chǎn)酸產(chǎn)氣⊕：CO2、H2

不分解：(-)

由于不同細(xì)菌菌體內(nèi)的酶系統(tǒng)不同，可分解單糖（葡萄糖）,雙糖（乳糖），多糖（淀粉）和醇類（甘露醇），糖苷（水楊苷），代謝產(chǎn)物也不一樣，可借此來鑒別細(xì)菌。酶19細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化培養(yǎng)基：肉膏湯+1%待試糖+指示劑→溶化調(diào)pH7.4±

→分裝→高壓滅菌冷后待用。

有液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。方法：把分純的細(xì)菌→1%糖(醇、苷)類培養(yǎng)基，35℃

18~24h→觀察結(jié)果。產(chǎn)酸產(chǎn)氣：如大腸埃希菌→GS→結(jié)果+產(chǎn)酸不產(chǎn)氣：如傷寒b、痢疾b→GS→+-培養(yǎng)基不變色：如卡他莫拉菌應(yīng)用：是鑒別細(xì)菌最主要和最基本的試驗，特別是腸桿菌科鑒定的主要試驗。⊕⊕20細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化2.氧化-發(fā)酵試驗(O/F試驗)原理：

分解GS—氧化型細(xì)菌，如微球菌、綠膿b

細(xì)菌

分解GS—發(fā)酵型細(xì)菌，如葡萄c、腸桿菌科

不分解GS—產(chǎn)堿型細(xì)菌，如莫拉莫拉菌培養(yǎng)基：HL培養(yǎng)基(蛋白胨2g、NaCl5g、GS10g、agar2.5g、K2HPO4·12H2O0.3g、0.2%溴麝香草酚蘭12ml、加蒸餾水至1000ml，調(diào)pH7.2）堿性時為綠色，酸性時為黃色。方法：將待測菌同時穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基，其中一支滴加無菌液體石蠟(高度不少于1cm)，35℃培養(yǎng)48h。有O2有O2或無O221細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化結(jié)果：應(yīng)用：檢測細(xì)菌的代謝類型，進(jìn)而鑒別細(xì)菌。如腸桿菌科細(xì)菌為發(fā)酵型，而非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌(發(fā)酵型)和微球菌(氧化型)的區(qū)別。注意事項：①對營養(yǎng)要求高的細(xì)菌應(yīng)在HL培養(yǎng)基中加入2%血清或0.1%的酵母浸膏。②陰性者要延長培養(yǎng)時間3~4天再觀察結(jié)果。③指示劑不能用酒精溶解。液體石蠟22細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化3.β-半乳糖苷酶(ONPG)試驗原理：ONPG

鄰-硝基酚

+

β-D-半乳糖試劑：0.75MONPG溶液，為無色，若出現(xiàn)黃色，則不應(yīng)再用。方法：從KIA斜面上刮取菌苔，加入0.25ml無菌NS制成菌懸液，加入1滴甲苯充分振搖，使β-半乳糖苷酶釋放，置37℃水浴5分鐘，加入0.25mlONPG試劑，水浴(35~37℃)20min~3h，觀察結(jié)果。結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性。β-半乳糖苷酶水解23細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化應(yīng)用：

本試驗主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。

遲緩分解乳糖的細(xì)菌(宋內(nèi)志賀菌等)只有β-半乳糖苷酶(胞內(nèi)酶)，缺乏半乳糖苷滲透酶(胞外酶)或活性很低，故需幾天才能將乳糖分解，若采用ONPG試驗則可迅速(20~30min)得出結(jié)果。

因為ONPG與乳糖十分相似，且分子較小，它不需半乳糖苷滲透酶則可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而被細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶分解為半乳糖和黃色的鄰-硝基酚。

ONPG試驗結(jié)果不一定與分解乳糖相一致，這主要取決于細(xì)菌產(chǎn)生的酶及其活性。若無ONPG，可采用5%的乳糖代替，同時減少蛋白胨的含量。24細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化4.七葉苷水解試驗原理：七葉苷(esculin)+H2O七葉素+GS七葉素+Fe2+(培養(yǎng)基中)黑色化合物培養(yǎng)基：

七葉苷培養(yǎng)基、膽汁七葉苷培養(yǎng)基。方法：

把待測菌接種于七葉苷培養(yǎng)基，35~37℃，18~24h。結(jié)果：

培養(yǎng)基變黑為陽性，不變色為陰性。應(yīng)用：

主要用于腸球菌(+)與其它鏈球菌(-)的鑒別。也可用于革蘭陰性桿菌(-)和厭氧菌(+)的鑒別。細(xì)菌25細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化5.甲基紅試驗(methylredtest)原理：GS丙酮酸→乳酸、甲酸、乙酸，pH↓

本試驗以甲基紅為指示劑，因此：當(dāng)pH﹥5.4時呈黃色，為陰性當(dāng)pH﹤4.5時呈紅色，為陽性當(dāng)pH在4.5~5.4時呈桔紅色，為弱陽性培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：將待測菌接種于上述培養(yǎng)基中，35℃2~4天，加入甲基

紅指示劑，立即觀察結(jié)果。應(yīng)用：用于鑒別大腸埃希菌(+)和產(chǎn)氣腸桿菌(-)，其他腸桿菌科中沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬均為陽性，而腸桿菌屬和哈夫尼亞屬均為陰性。產(chǎn)氣桿菌26細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化6.V-P試驗(Voges-Proskauertest)原理：細(xì)菌→GS→丙酮酸乙酰甲基甲醇+CO2乙酰甲基甲醇

丁二酮(二乙酰)丁二酮+胍基(培養(yǎng)基中精氨酸中含有胍基)→紅色化合物培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：將待測菌接種于上述培養(yǎng)基中，35℃48h后，加入甲液(6%α-萘酚酒精溶液)和乙液(40%KOH)，振搖。結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽性，若無紅色出現(xiàn)且置于35℃4h后仍如故者為陰性。應(yīng)用：本試驗與甲基紅試驗往往同時使用，一般前者為陽性，后者為陰性。脫羧-2HKOH27細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化(二)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1.明膠液化試驗：原理：某些細(xì)菌半固體明膠氨基酸變成流動的液體。方法：待測菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，22℃7天，觀察結(jié)果。35℃中明膠自動液化，若在35℃培養(yǎng)，觀察前先置于4℃中30分鐘后，再看結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。Eg：沙雷菌，普通變形桿菌，奇異變形桿菌，陰溝桿菌；某些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌；多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。明膠酶(胞外酶)分解28細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化2.吲哚試驗(IndoleTest)原理：

色氨酸吲哚+丙酮酸

吲哚+吲哚試劑(對二甲氨基苯甲醛)→玫瑰吲哚培養(yǎng)基：蛋白胨水方法：將待測菌接種于上述培養(yǎng)基中，35℃24~48h，加入吲哚試劑，觀察結(jié)果結(jié)果：于兩者液面交界處出現(xiàn)紅色為陽性，不變色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別，如大腸埃希菌為(+)，產(chǎn)氣腸桿菌(-)。色氨酸酶某些細(xì)菌29細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化4.尿素分解試驗原理：某些細(xì)菌具有尿素酶，使尿素分解產(chǎn)生大量氨，

使培養(yǎng)基呈堿性(酚紅為指示劑)，培養(yǎng)基變紅。培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基方法：

將待測菌接種于上述培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變紅為陽性，不變色為陰性。應(yīng)用：主要用于變形桿菌屬的鑒定，另外雷氏普羅威登菌和莫根菌也為陽性。31細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化5.苯丙氨酸脫氨酶試驗原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，加入FeCl3試劑后呈綠色反應(yīng)。培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基方法：將待測菌接種于上述斜面培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18~24h，滴加3滴FeCl3試劑，自上流下，立即觀察結(jié)果。若延長時間觀察會引起褪色。結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌、摩根摩根菌為陽性。32細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化6.氨基酸脫羧酶試驗原理：氨基酸

胺+CO2，胺使培養(yǎng)基變堿，指示劑則變色。培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶和氨基酸對照培養(yǎng)基。方法：將待測菌接種于上述培養(yǎng)基中，35℃1~4天，觀察結(jié)果。結(jié)果：對照管呈黃色，測定管呈紫色(溴甲酚紫為指示劑)為陽性，若測定管也為黃色則為陰性。若對照管呈紫色則試驗毫無價值。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，均陽性。志賀菌中除宋內(nèi)和鮑氏外，均陰性特異脫羧酶33細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化賴氨酸→尸胺鳥氨酸→腐胺精氨酸→精胺34細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化(三)碳源和氮源利用試驗1.枸櫞酸鹽利用試驗(citratetest)原理：某些細(xì)菌能分解枸櫞酸鹽(獲得碳源)，使培養(yǎng)基變堿(原pH6.8→pH↑)，培養(yǎng)基(溴麝香草酚蘭為指示劑)由淡綠變?yōu)樯钏{(lán)色。培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽斜面培養(yǎng)基方法：將待測菌接種于上述培養(yǎng)基中，35℃1~4天，觀察結(jié)果。結(jié)果：由淡綠變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，不變色為陰性。應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌與屬的鑒定。如沙門菌屬、克雷伯菌屬一般為陽性，其他菌屬一般為陰性。35細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化2.丙二酸鹽利用試驗原理：某些細(xì)菌能將丙二酸鹽分解成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿(原pH6.8→pH↑)，培養(yǎng)基(溴麝香草酚蘭為指示劑)由淡綠變?yōu)樯钏{(lán)色。培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基方法：將待測菌接種于上述培養(yǎng)基中，35℃1~2天，觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性(指示劑同上)，不變色為陰性。應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定?？死撞鷮伲瑏喞Ｄ蔷鸀殛栃?。36細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化IMViC試驗*：是鑒別細(xì)菌常用的一組生化試驗。

IMVC如：大腸埃希菌++--產(chǎn)氣腸桿菌--++37細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化（四）各種酶類試驗1.氧化酶試驗(kovactest)原理：還原型細(xì)胞色素C氧化型細(xì)胞色素C四甲基對苯二胺有色的醌類化合物方法：①濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，沾菌少許，滴加試劑。②試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙片上。 ③菌落法：直接滴加試劑于被檢菌落上。結(jié)果：10秒鐘內(nèi)呈深紫色為陽性。同時應(yīng)以銅綠假單胞菌(+)與大腸埃希菌(-)做對照。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別（發(fā)酵菌與非發(fā)酵菌鑒別），另外奈瑟菌屬和莫拉菌屬也呈陽性反應(yīng)。細(xì)菌氧化酶氧化型細(xì)胞色素C38細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化2.觸酶試驗(H2O2酶試驗)原理：具有觸酶的細(xì)菌，能催化H2O2生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。即：H2O2H20+O2↑(出現(xiàn)氣泡)試劑：3%過氧化氫溶液方法：玻片法和試管法結(jié)果：產(chǎn)生氣泡為陽性，不產(chǎn)生氣泡為陰性應(yīng)用：常用于G+C的初步鑒定，如葡萄球菌(+)，而鏈球菌為(-)。觸酶39細(xì)菌分離培養(yǎng)接種技術(shù)和生化3.硝酸鹽還原試驗(nitratereductivetest)原理：硝酸鹽亞硝酸鹽+氨亞硝酸鹽+試劑→顏色反應(yīng)(紅色)培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基試劑：甲液(對氨基苯磺酸溶液)；乙液(α萘胺醋酸溶液)方法：將待測菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，35℃1~4天，加入0.1ml甲、乙等量混合液，搖勻，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：呈紅色為陽性，若加入試劑后無顏色反應(yīng)可能為：

①硝酸鹽沒有被還原，試驗為陰性。②若再加入少許鋅粉，呈紅色者則表明試驗確為陰性，若仍不產(chǎn)生紅色者為假陰性(鋅＋亞硝酸＝紅色芳基肼)應(yīng)用：如腸桿菌科細(xì)菌均為陽性;銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌可產(chǎn)生氮(放入一倒管檢測);