重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)課件

重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)1原核表達(dá)系統(tǒng)2酵母表達(dá)系統(tǒng)·3昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)4哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)·5轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)6轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng),7,表達(dá)系統(tǒng)的選擇一、原核表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展完善、流程簡單快速、成本低、產(chǎn)量高,對(duì)大部分蛋白來說都值得一試,尤其適宜于表達(dá)原核來源的以及不需要翻譯后修飾的真核蛋白。11表達(dá)菌株原核表達(dá)系統(tǒng)剛用的宿主菌有E.cof,Bacillus等。其中革蘭式陽性的Bacillus更適宜在其周質(zhì)空間分泌表達(dá)重組蛋白;革蘭氏陰性的E.coJ能夠廣譜表達(dá)異源蛋白·大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前發(fā)展最完善的重組舒白表達(dá)系統(tǒng)常用大腸桿菌菌株有tar、DE3)等,這些菌株都敲除了蛋白酶,并溶源了噬菌體DE3。DE3是的一種衍生λ噬菌體,帶有噬菌體21抗性區(qū)和loc基因,表2常用Eco表達(dá)菌株常用表達(dá)恢對(duì)照味,不能使用T啟廳,蛋素(4g叫m營養(yǎng)缺鞋性,對(duì)長,不能使B8DE)營養(yǎng)陷性,蛋酸除無y液來變,可持達(dá)木對(duì)長:不菲用了啟動(dòng)子蛋提供講器子sA蛋(H2m)日除82DEy常表達(dá)宿主菌,日除無高嚴(yán)表達(dá)宿主苗,c鞅20Ey言嚴(yán)表音面,蛋白稱除氯晴素(m)ka變,可制達(dá)時(shí)平,待有氯篇素g常表達(dá)在菌,在三中密碼子NA至白酶歇ltb(DE)邢成二鍵,蛋白四:125gm高緊表宿主,在c0胞質(zhì)卡那票(lgamBL2ltrbDEplyss下二資鍵,蛋上除黑素(34gml氯素(思m0mgm8,不鐵用T啟動(dòng)子常來之主2,更的Es:085取mEF胞下成二:捏件樣有密碼卡麥(!:igam)野好Ec四(25gm和二詳E#.(sgml)0D0s“含達(dá)主,恿子的在厚(2m)Eci中形二嵌律卡提嘉(m)3DE)E以息小說成二,?？?1業(yè)值12質(zhì)粒載體·大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)采用質(zhì)粒為表達(dá)載體,質(zhì)粒上的重要元件包括復(fù)制子,啟動(dòng)子,終止子,多克隆位點(diǎn),信號(hào)肽,融合標(biāo)簽,篩選標(biāo)記等(圖1)。原核表達(dá)載體已經(jīng)發(fā)展得比較完善,有多種質(zhì)?？晒┻x擇(表4)復(fù)制子復(fù)制子決定著質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)。通常情況下質(zhì)粒拷貝數(shù)越高,重組蛋白的表達(dá)量就越高,但是高拷貝的質(zhì)粒也會(huì)重影響宿主的生長,質(zhì)粒本身也不穩(wěn)定,啟動(dòng)子:表達(dá)重組蛋白時(shí),我們需要考慮啟動(dòng)子的強(qiáng)弱、作用方式、調(diào)控方式和本底表達(dá)水平。表達(dá)載體通常選用強(qiáng)啟動(dòng)子以提高表二達(dá)量,但弱啟動(dòng)子也有其優(yōu)點(diǎn),如降低本底表達(dá)、增加可溶表達(dá)、表達(dá)小量伴侶蛋白等。按照作用方式,啟動(dòng)子可以分為兩類:組成型表達(dá)的啟動(dòng)子使宿主不停地表達(dá)重組蛋白,常用于工業(yè)生產(chǎn),如。等;誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動(dòng)子使宿主僅在受到誘導(dǎo)(誘導(dǎo)劑、溫度等)時(shí)表達(dá)目的蛋白,誘導(dǎo)型啟動(dòng)子使重組蛋白的表達(dá)容易控制同時(shí)降低了外源蛋白對(duì)細(xì)菌生長的影響圖1:大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)圖譜及多克隆位點(diǎn)。k22060275ApaBI(98)sca制45Pvuk4478》P4重Ea11051encpET-22b(+)525AIwN16631)BspLU111(321sB|21Tth11122960eSpnkazanPrometie斷83boperatoBseIpeBkaderBymHIEcolSxIAA11AC$民’《《其【《【G【4GACA【AhelLysTyrLesLeuFroThrlualoklaseulaLeuAlalo,.:Alg14soIl-s1yIeaiSerAipProAsnS4f.signpepinHi.gud102TtermnabrT7Mmiatime93373TARCATAaKCCIIG4A:<TCIAAACGRaICI1G4Gs91rI1IT早期大腸桿菌表達(dá)體系中,常見的啟動(dòng)子是c和ocU5。c是一個(gè)弱啟動(dòng)子,很難使外源基因得到高表達(dá)。目前使用的含有需要小量共表達(dá)的蛋白(如分子伴侶,蛋白抑制劑等)的載體,有很多都采用了經(jīng)典的c啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子中,tc和trc是oc動(dòng)子的變體,其重組蛋白產(chǎn)率能夠達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的15-30%。arabad啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑是便宜無毒的L阿拉伯糖,本底表達(dá)量低,啟動(dòng)能力比tac稍弱。T7則是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中最高效的啟動(dòng)子,pE表達(dá)系統(tǒng)即是以它為中心構(gòu)建的。T7啟動(dòng)子來源于λ噬菌體,專一終止子:·轉(zhuǎn)錄終止子按照是否依賴和不依賴p因子的作用分為兩類,這兩類終止子均在終止點(diǎn)前含有一段7-20bp的回文序列。終止子可以保護(hù)mRNA在核外不被降解,顯著延長mRNA的壽命,由此提高重組蛋白的表達(dá)量。但是對(duì)于T7系統(tǒng)來說,由于T7RNA聚合酶