一-紫外可見(jiàn)吸收光譜法課件

第九章可見(jiàn)紫外吸收光譜分析分子光譜有機(jī)化合物的吸收光譜可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)儀器性能及其對(duì)測(cè)定的影響提高分析準(zhǔn)確度的方法第九章可見(jiàn)紫外吸收光譜分析分子光譜分子光譜分子是由原子組成的，分子的運(yùn)動(dòng)包括分子中電子的運(yùn)動(dòng)、分子的振動(dòng)及其轉(zhuǎn)動(dòng)，所有這些運(yùn)動(dòng)都必須由能量來(lái)維持，故分子的能量包括：

E分子=Ee+Ev+Er右邊是分子的能級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖：電子能級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)振動(dòng)能級(jí)分子光譜分子是由原子組成的，分子的運(yùn)動(dòng)包括分子中電子的運(yùn)動(dòng)、分子吸收光譜由于分子能量由三部分組成，當(dāng)分子處于輻射中時(shí)，故可以形成相對(duì)應(yīng)的三類光譜：轉(zhuǎn)動(dòng)光譜或遠(yuǎn)紅外光譜，對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)范圍在25m～12.5cm，屬于遠(yuǎn)紅外區(qū)和微波區(qū)，分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)差r在0.05～110-4ev。紅外光譜或振-轉(zhuǎn)光譜，對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)范圍在1.25m～25m，屬于紅外區(qū)，分子的振動(dòng)能級(jí)差v在1～0.05ev之間，又由于在分子振動(dòng)的同時(shí)伴隨有分子的轉(zhuǎn)動(dòng)，振-轉(zhuǎn)光譜。電子光譜或可見(jiàn)-紫外光譜，主要分布在可見(jiàn)-紫外光譜區(qū)，對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)范圍在100～1000nm之間，電子在分子軌道間的躍遷能級(jí)差e在1～20ev之間。分子吸收光譜由于分子能量由三部分組成，當(dāng)分子處于輻射中時(shí)，故分子發(fā)射光譜同原子一樣，處于高能態(tài)的分子也是不穩(wěn)定的，當(dāng)其返回基態(tài)（能量最低態(tài)，此時(shí)的具有的能量叫做零點(diǎn)能）時(shí)，若以光的形式釋放所吸收的能量則形成分子發(fā)射光譜，最常見(jiàn)的分子發(fā)射光譜是分子熒光。分子熒光的原理是：處于第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)的電子以無(wú)輻射方式（熱或分子間碰撞轉(zhuǎn)移吸收的能量）過(guò)渡到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再由此能級(jí)返回基態(tài)不同不同振動(dòng)能級(jí)，若以光的形式釋放能量，這種光稱為熒光。波長(zhǎng)范圍同可見(jiàn)-紫外。分子發(fā)射光譜同原子一樣，處于高能態(tài)的分子也是不穩(wěn)定的，當(dāng)其分子光譜的輪廓（或形狀）分子光譜的輪廓（或形狀）與分子所處的環(huán)境有關(guān)。在液體環(huán)境中，由于吸光分子間的距離很近，分子三種能級(jí)會(huì)相互作用，加上溶劑的作用，使能級(jí)界限模糊，導(dǎo)致吸收譜帶變寬，接近或超過(guò)了譜線的自然寬度，表觀上看不出精細(xì)結(jié)構(gòu)。此外單色器的分辨率有限。這樣，在液體中我們只能看到一條能量隨波長(zhǎng)變化的曲線，稱為分子的吸收曲線。對(duì)于紅外光譜分析，為了得到待測(cè)化合物的精細(xì)結(jié)構(gòu)，必須把樣品轉(zhuǎn)化為氣體或制成很薄的薄片，減少或消除樣品分子間的相互作用，這樣才能得到分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)，如采用石蠟油薄層。分子光譜的輪廓（或形狀）分子光譜的輪廓（或形狀）與分子所處有機(jī)化合物的吸收光譜紫外可見(jiàn)吸收光譜法在有機(jī)化合物定性分析中的應(yīng)用就是將光譜的各個(gè)細(xì)節(jié)如max、min、拐點(diǎn)與值等參數(shù)與已知純化合物的光譜進(jìn)行比較，如果一致則有可能是同一化合物。溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜，由于溶劑分子和待測(cè)化合物分子的相互作用，使得電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的不確定性增加，導(dǎo)致吸收或發(fā)射光譜變寬，呈現(xiàn)出較寬的分子吸收光譜，缺少光譜細(xì)節(jié)。因此，不能直接應(yīng)用于分子鑒定，但是可以檢驗(yàn)?zāi)承┨囟ǖ墓倌軋F(tuán)，如羧基、芳環(huán)、硝基和軛系統(tǒng)。有機(jī)化合物的吸收光譜紫外可見(jiàn)吸收光譜法在有機(jī)化合物定性分析中有機(jī)化合物的吸收光譜_定性在定性分析中，常用的方法如下：測(cè)定某些有機(jī)物的max、與文獻(xiàn)記錄的標(biāo)準(zhǔn)樣品的光譜進(jìn)行比對(duì)，若2者的光譜相同，則可能為同一物質(zhì)。做出已知同類型的標(biāo)準(zhǔn)化合物的光譜，并與待測(cè)物質(zhì)的光譜比較，然后依據(jù)該類型化合物的結(jié)構(gòu)與光譜之間的變化規(guī)律做出判斷。有機(jī)化合物的吸收光譜_定性在定性分析中，常用的方法如下：有機(jī)化合物的吸收光譜_結(jié)構(gòu)與光譜如在200nm到400nm區(qū)域內(nèi)沒(méi)有吸收峰，則可以初步判斷待測(cè)化合物無(wú)共軛雙鍵；若250nm處有吸收峰，而且max約103-104時(shí)，化合物可能具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，如果芳香環(huán)被取代而使共軛體系延長(zhǎng)時(shí)，max大于104。如在270-350nm區(qū)域有弱的吸收峰，max大約10到100，且200nm以上無(wú)其它吸收，說(shuō)明該化合物含有帶孤對(duì)電子的未共軛的生色團(tuán)，如：C=O....C=..C—O—

..C=..C—N和有機(jī)化合物的吸收光譜_結(jié)構(gòu)與光譜如在200nm到400nm區(qū)有機(jī)化合物的吸收光譜_結(jié)構(gòu)與光譜4.若化合物長(zhǎng)波吸收峰的max約1104

—2104之間時(shí)，表示具有、—不飽和酮或共軛烯烴；5.如化合物紫外光譜中有許多吸收峰，并有一些峰出現(xiàn)在可見(jiàn)區(qū)域，則該化合物可能具有長(zhǎng)鏈共軛體系或稠環(huán)芳香化生色團(tuán)，如果化合物有顏色，則至少有4—

5個(gè)相互共軛的發(fā)色團(tuán)（雙鍵結(jié)構(gòu)）。不包括含氮化合物與碘仿。除了以上經(jīng)驗(yàn)規(guī)律外，還要注意光譜的測(cè)定條件（如溶劑、溫度、儀器狹縫寬度）對(duì)光譜的形狀的影響。生色團(tuán)對(duì)光的吸收特性參見(jiàn)教材。有機(jī)化合物的吸收光譜_結(jié)構(gòu)與光譜4.若化合物長(zhǎng)波吸收峰的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_結(jié)構(gòu)

光源單色器檢測(cè)器放大器比色槽顯示穩(wěn)壓電源鎢燈或鹵素?zé)?，氫燈或氘燈棱鏡或光柵，玻璃或石英玻璃或石英比色皿光電池或光電管對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換或不轉(zhuǎn)換模擬或數(shù)字，微機(jī)處理與否紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_結(jié)構(gòu)光源單色器檢測(cè)器放大器比色槽顯示紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_示意圖紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_示意圖紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_光源重點(diǎn)掌握光源的強(qiáng)度和光譜特性指標(biāo)，前者與儀器靈敏度有關(guān)，后者與該儀器可使用的波長(zhǎng)范圍有關(guān)。氫燈氙弧燈鎢燈強(qiáng)度紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_光源重點(diǎn)掌握光源的強(qiáng)度和光譜特紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_單色器從分光元件角度可以分為兩類，一是光柵單色器，二是棱鏡單色器，它們的特點(diǎn)與性能比較如下：棱鏡光柵原理特點(diǎn)應(yīng)用不同波長(zhǎng)折射率不同非勻排光譜，色散率與波長(zhǎng)呈反比。無(wú)光譜級(jí)干擾，直接在光譜面上分出單色光。玻璃400～1000nm石英200～400nm單縫衍射，多縫干涉的總效果。勻排光譜，色散率與波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，有光譜級(jí)重疊干擾，加濾光片解決.200～1000nmm1m=紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_單色器從分光元件角度可以分為兩紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_色散率分光元件的色散率或線色散率，即指單位波長(zhǎng)在光譜面上的展開(kāi)程度，用其倒數(shù)，倒色散率即單位寬度光譜面上所包括的波長(zhǎng)范圍來(lái)表示，光譜級(jí)的干擾從上向下發(fā)生在各級(jí)光譜的一半處，若1=1200nm，則2=600nm和3=300nm會(huì)發(fā)生相互重疊，一般用濾光片的中心波長(zhǎng)排除干擾，選擇需要的波長(zhǎng)。dlddld紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_色散率分光元件的色散率或線色散率紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_波長(zhǎng)分辨率根據(jù)瑞利準(zhǔn)則，當(dāng)一條譜線輻射強(qiáng)度的最大值恰好落在相鄰譜線的極小值上時(shí)，則認(rèn)為兩條譜線實(shí)際上分開(kāi)了，此時(shí)兩條譜線的平均波長(zhǎng)與波長(zhǎng)差的比值定義為分辨率。計(jì)算式如下：

R=(1+2)/21-2值得注意的是，R是理論值，實(shí)際值與理論值有時(shí)相差很大。12I紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_波長(zhǎng)分辨率根據(jù)瑞利準(zhǔn)則，當(dāng)一條譜線輻射紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_狹縫與帶寬狹縫：一般分光光度計(jì)的出射狹縫是不變的，如721、722型，分別為0.2nm和0.3～0.5nm，對(duì)于中、高檔儀器，狹縫是可變的，如751，狹縫的改變對(duì)分析結(jié)果有很大的影響。帶寬：?jiǎn)紊鞒龉猹M縫所包含的“單色光”的波長(zhǎng)范圍。 W或=S（倒線色散率乘以狹縫寬度）在帶寬內(nèi)仍然具有波長(zhǎng)范圍，表明處處有光，且光不是嚴(yán)格單色的。dld紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_狹縫與帶寬狹縫：一般分光光度計(jì)的出射狹蠕動(dòng)泵紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_樣品室一般用比色皿，但存在不一致的問(wèn)題，且操作麻煩，近年來(lái)流動(dòng)比色皿發(fā)展較快，既可替代常用比色皿，而且可以組配成自動(dòng)分析儀器。出口進(jìn)口光路蠕動(dòng)泵流動(dòng)比色皿顯色進(jìn)樣試劑顯色溫度和時(shí)間（管子長(zhǎng)度）蠕動(dòng)泵紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_樣品室一般用比色皿，但存在不一致紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_自動(dòng)分析儀紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_自動(dòng)分析儀紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_樣品室普通流動(dòng)比色皿帶檢測(cè)器的流動(dòng)比色皿紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_樣品室普通流動(dòng)比色皿帶檢測(cè)器的流動(dòng)比色紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_蠕動(dòng)泵正面觀側(cè)面觀通過(guò)使用不同直徑的硅橡膠管，比例控制不同溶液的流量，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)稀釋、混合顯色分析。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_蠕動(dòng)泵正面觀側(cè)面觀通過(guò)使用不同直徑的硅紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_檢測(cè)器常用有三種1.光電池，又分為硒、硅之分，前者靈敏度與人眼的波長(zhǎng)靈敏度差不多，為550nm左右，后者在800nm，且后者的短波長(zhǎng)反應(yīng)不好，目前已有所改進(jìn)。2.光電管，使用逐漸增多。3.光電倍增管，使用不多。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_檢測(cè)器常用有三種紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_光電管紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_光電管紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_放大與顯示放大與顯示。對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換或不轉(zhuǎn)換，模擬或數(shù)字顯示。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，微機(jī)信息處理技術(shù)快速引入儀器設(shè)備，如自動(dòng)調(diào)節(jié)波長(zhǎng)、自動(dòng)調(diào)零、顯示峰值吸收或積分吸收，繪制化合物吸收光譜曲線等。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_放大與顯示放大與顯示。對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換或不轉(zhuǎn)換紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_技術(shù)指標(biāo)波長(zhǎng)范圍： 320～800（721）；200～1000（751）波長(zhǎng)精度：一般3nm，751在600nm以上可達(dá)1.5nm波長(zhǎng)重現(xiàn)性：一般1.5nm測(cè)量范圍：0～100T；0～2A或0～3A測(cè)量精度：0.5T%；751可達(dá)0.3T%雜散光：1%T。對(duì)于中、高檔儀器，還有波長(zhǎng)分辨率，對(duì)譜線的分離程度，一般能分開(kāi)Hg三線（365.0、365.5、366.3nm），狹縫可調(diào)范圍（一般0～2nm），靈敏度等指標(biāo)。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)_技術(shù)指標(biāo)波長(zhǎng)范圍： 320～800（7儀器特性對(duì)測(cè)定的影響_帶寬帶寬的選擇原則是：要求單色光的帶寬吸收峰寬的1/5，否則會(huì)由于帶寬范圍內(nèi)，物質(zhì)的吸光系數(shù)不同而導(dǎo)致對(duì)朗-比定律的偏移，造成標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率降低（靈敏度降低）和線性范圍變窄。帶寬增加一倍，光強(qiáng)增加四倍，因而被測(cè)物質(zhì)溶液的吸收峰較寬時(shí)，可借助加大狹縫測(cè)定較濃的試液，或減少儀器的放大倍數(shù)，提高儀器測(cè)定的穩(wěn)定性。而對(duì)于狹縫不可調(diào)的儀器，則應(yīng)避免選用窄吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)作為工作波長(zhǎng)，或保證在5倍帶寬范圍內(nèi)，吸收曲線的斜率變化盡可能小。儀器特性對(duì)測(cè)定的影響_帶寬帶寬的選擇原則是：要求單色光的帶儀器特性對(duì)測(cè)定的影響_帶寬選擇Cx1/2Cx12A2測(cè)定1測(cè)定1/2CxCxCCAA1=2儀器特性對(duì)測(cè)定的影響_帶寬選擇Cx1/2Cx12A2儀器特性對(duì)測(cè)定的影響_波長(zhǎng)準(zhǔn)確度影響帶寬的估計(jì)；影響應(yīng)用公式法測(cè)定的準(zhǔn)確度；難以獲得待測(cè)物質(zhì)的特征光譜曲線。儀器波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的測(cè)定與校正，請(qǐng)同學(xué)們參閱實(shí)驗(yàn)一相關(guān)內(nèi)容。儀器特性對(duì)測(cè)定的影響_波長(zhǎng)準(zhǔn)確度影響帶寬的估計(jì)；儀器特性對(duì)測(cè)定的影響_讀數(shù)誤差透光率讀數(shù)誤差對(duì)測(cè)定的影響 對(duì)于任何一臺(tái)儀器，讀數(shù)誤差是確定的，如721為0.5%T，751為0.3%T。儀器讀數(shù)誤差與濃度測(cè)定誤差的估計(jì)式如下：CC100=0.4343TTlogT100適宜讀數(shù)范圍：T=0.12～0.70，對(duì)應(yīng)的吸光度A=0.92～0.15，在此范圍內(nèi)，可以控制濃度測(cè)定誤差小于2%。儀器特性對(duì)測(cè)定的影響_讀數(shù)誤差透光率讀數(shù)誤差對(duì)測(cè)定的影響C定量分析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法和工作曲線法：兩者的區(qū)別是后者加入試劑空白，略。2.公式計(jì)算法： 已知待測(cè)物質(zhì)在某一波長(zhǎng)處的摩爾吸收，通過(guò)A=cl公式，由吸光度直接計(jì)算濃度。該方法要求儀器的波長(zhǎng)精度和準(zhǔn)確度較高。如核酸在263nm處的吸收，又如葉綠素a在663nm的吸收和葉綠素B在645nm的吸收，都是特征吸收，可利用公式計(jì)算法測(cè)定。但是對(duì)于葉綠素分析，由于兩波長(zhǎng)相距太近，如果儀器帶寬達(dá)不到要求，不能使用公式計(jì)算法測(cè)定。定量分析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法和工作曲線法：兩者的區(qū)別是后者加提高分析準(zhǔn)確度的方法由透光率讀數(shù)對(duì)濃度測(cè)定誤差的關(guān)系可見(jiàn)，在T=0.005時(shí)，若吸光度0.9或0.12，濃度測(cè)定誤差就會(huì)大于2%，但在實(shí)際工作中常常會(huì)碰到這種情況，為了保證測(cè)量精度，人們提出了三種定量測(cè)定方法，即高吸光度法、低吸光度法和極限精密法，這三種方法都與儀器性能有關(guān)，原理也基本一樣，都是利用儀器的靈敏度和補(bǔ)償功能，擴(kuò)展透光率標(biāo)尺。其中高吸光度法對(duì)儀器的要求不高，因而獲得了較為廣泛的使用。具體操作和計(jì)算公式如下：提高分析準(zhǔn)確度的