分泌蛋白的追蹤

分泌蛋白的追蹤第1頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目錄一.研究背景二.實(shí)驗(yàn)過(guò)程三.討論第2頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1945年，克勞德和泡特(KeithRobertsPorter，1912—1997)發(fā)表了培養(yǎng)細(xì)胞的第一張電子顯微鏡照片，首次發(fā)現(xiàn)了一些新的細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)一線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這次重大突破開(kāi)啟了現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的一扇大門(mén)，為隨后全面深入研究細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。帕拉德對(duì)細(xì)胞電子顯微鏡研究的一項(xiàng)重大貢獻(xiàn)是改進(jìn)了細(xì)胞固定技術(shù)。當(dāng)時(shí)鋨酸(Os04)由于可快速高效保持培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)而被廣泛應(yīng)用于電子顯微鏡研究，但鋨酸對(duì)生物組織內(nèi)的細(xì)胞研究卻存在很大困難。帕拉德認(rèn)為這是由于鋨酸酸性難以控制的原因，因此引入緩沖液方法以保證相對(duì)穩(wěn)定的pH，這種改進(jìn)使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究成為可能，這種固定液也被稱(chēng)為帕拉德固定液[5]。帕拉德還對(duì)電子顯微鏡研究的其他方面進(jìn)行了革新，如塑料包埋材料的應(yīng)用和超薄切片技術(shù)的完善，這使2O世紀(jì)5O年代早期細(xì)胞電子顯微鏡照片清晰度得到極大提高，從而發(fā)現(xiàn)了更多的細(xì)胞內(nèi)細(xì)節(jié)。第3頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月將細(xì)胞與放射性標(biāo)記的合成底物(屬于某些途徑或大分子)一起培養(yǎng)，則標(biāo)記結(jié)果將在下一步與非標(biāo)記底物共培養(yǎng)中延續(xù).脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)：用放射性同位素標(biāo)記的前體化合物對(duì)細(xì)胞或個(gè)體進(jìn)行短時(shí)間的標(biāo)記，以研究代謝合成動(dòng)態(tài)的生物技術(shù)。放射自顯影術(shù)（radioautography；autoradiography）用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過(guò)顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對(duì)標(biāo)記上放射性的化合物進(jìn)行定位或相對(duì)定量測(cè)定。第4頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究背景除了合成蛋白質(zhì)來(lái)行使細(xì)胞功能，許多細(xì)胞還必須產(chǎn)生和分泌其他蛋白到細(xì)胞外履行職責(zé)。蛋白分泌的機(jī)制迷住了許多細(xì)胞生物學(xué)家，包括帕拉德。在分泌的研究的早期，細(xì)胞被破壞，各種細(xì)胞器被離心分離。這些細(xì)胞分級(jí)分離的研究表明，分泌的蛋白是存在于與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）相關(guān)聯(lián)的膜結(jié)合的囊泡細(xì)胞和質(zhì)膜，在那里它們被合成，并被最終從釋放.為了進(jìn)一步闡明的途徑，帕拉德轉(zhuǎn)向了新開(kāi)發(fā)的技術(shù)，高分辨率放射自顯影，放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)移動(dòng)時(shí),使他可以跟蹤它們。他的工作產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義的發(fā)現(xiàn)是該分泌蛋白在囊泡內(nèi)的移動(dòng)是從ER到高爾基復(fù)合體，然后到質(zhì)膜。第5頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月帕拉德由于對(duì)現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)誕生和發(fā)展做出了許多奠基性貢獻(xiàn)而被生物學(xué)界譽(yù)為“現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)之父”第6頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月帕拉德想要確定哪些細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器參與蛋白質(zhì)的分泌？1.給豚鼠注射[3H]亮氨酸2.從4分鐘到15小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，將動(dòng)物處死，并且固定胰腺組織.（因?yàn)榕晾掳l(fā)現(xiàn)該器官擁有大量分泌細(xì)胞，這些分泌細(xì)胞存在大量粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且還發(fā)現(xiàn)胰腺分泌細(xì)胞中的酶原顆?？勺鳛橄傅臅簳r(shí)儲(chǔ)存位點(diǎn)。

第7頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月為了徹底解決這一細(xì)胞器的蛋白分泌的作用?（為了闡明蛋白分泌過(guò)程，帕拉德再一次在技術(shù)上做出了重大革新——他改進(jìn)了適合蛋白質(zhì)研究的細(xì)胞內(nèi)同位素示蹤體系，同時(shí)還發(fā)展了放射自顯影的電子顯微鏡方法）體外脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)細(xì)胞暴露于放射性標(biāo)記的前體

.這種情況下,[H3]亮氨酸,短時(shí)間內(nèi)被稱(chēng)為“脈沖”。

隨后的“追”的時(shí)期,放射性前體用未標(biāo)記的形式取代.1.通過(guò)削減豚鼠胰腺切成厚片，2.將其培養(yǎng)含有[3H]亮氨酸的媒體中3分鐘。

3.加入過(guò)量未標(biāo)記的亮氨酸(在脈沖結(jié)束時(shí))。4.組織切片5.然后固定為放射自顯影或用于細(xì)胞分離第8頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電子顯微鏡放射自顯影所揭示的是豚鼠胰腺分泌蛋白的合成和移動(dòng)。（a）在一個(gè)3分鐘的時(shí)間標(biāo)記與[3H]亮氨酸結(jié)束時(shí)，組織被固定，切片電子顯微鏡，并進(jìn)行放射自顯影。大多數(shù)標(biāo)記的蛋白質(zhì)（放射自顯影顆粒）是在粗糙的急診室。（二）經(jīng)過(guò)7分鐘的追逐與內(nèi)未標(biāo)記的亮氨酸，大多數(shù)標(biāo)記的蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到高爾基體囊泡。（三）有37分鐘的追逐后，大部分的蛋白質(zhì)是在不成熟的分泌囊泡。（四）一個(gè)117分鐘的追逐后，大部分蛋白質(zhì)是在成熟的酶原顆粒。第9頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第10頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月技術(shù)上的改進(jìn)使研究進(jìn)程大大加快，帕拉德和同事首先為哺乳動(dòng)物注射放射性同位素標(biāo)記的氨基酸(H標(biāo)記亮氨酸)，然后分離亞細(xì)胞成分，以觀察新合成的帶有放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)特征。借助這些方法，帕拉德最終發(fā)現(xiàn)分泌蛋白首先在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的核糖體上合成，隨后被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，在這里合成的多肽鏈折疊成為適宜分泌的蛋白結(jié)構(gòu)，最后進(jìn)入分泌囊泡第11頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月為了確保他的結(jié)果是蛋白分泌在體內(nèi)的準(zhǔn)確反映，帕拉德精心設(shè)計(jì)系統(tǒng)?用[3H]亮氨酸脈沖標(biāo)記組織切片3分鐘用未標(biāo)記的亮氨酸追逐的標(biāo)簽7，17，37，57，和117分鐘.第12頁(yè)，課件共14頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月拉德的實(shí)驗(yàn)給了生物學(xué)家首先明確一下蛋白質(zhì)通過(guò)分泌途徑移動(dòng)。他對(duì)胰腺外分泌細(xì)胞的研究結(jié)果產(chǎn)生了兩個(gè)開(kāi)創(chuàng)性的看法。1.該分泌蛋白穿過(guò)他們的方式進(jìn)出細(xì)胞的高爾基復(fù)合體2.分泌蛋