核酸提取常見試劑地作用原理

異硫氰酸胍強(qiáng)用力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離。胍鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑，在通常使用的蛋白質(zhì)變性劑中作用最強(qiáng)的是異硫氰酸胍，它們可以使多數(shù)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成一隨機(jī)的卷曲狀態(tài)。含有強(qiáng)力的陰離子和陽離子基團(tuán)，它們可以形成較強(qiáng)的氫鍵。在還原劑存在的情況下，異硫氰酸胍可以斷裂氫鍵，而去垢劑，如 存在的情況下，可以破壞疏水作用。鹽酸胍、尿素鹽酸胍是一個核酸酶的強(qiáng)抑制劑，它并不是一種足夠強(qiáng)的變性劑，可以允許完整的從富含 的組織中提取出來?？蓴嗔褮滏I，有兩種可能機(jī)制：變性蛋白和鹽酸胍、尿素優(yōu)先結(jié)合，形成變性蛋白變性劑復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物被除去，從而引起反應(yīng)平衡向右移動，隨著變性劑濃度增加，天然狀態(tài)的蛋白不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性；2鹽酸胍、尿素對氨基酸的增溶作用，能形成氫鍵，當(dāng)濃度高時，能破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)，結(jié)果鹽酸胍、尿素就稱為非極性殘基的較好溶劑，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基伸展和溶解性加強(qiáng)，鹽酸胍、尿素引起的變性往往是不可逆的。高濃度尿素使蛋白質(zhì)變性并抑制 活性十二烷基肌氨酸鈉使蛋白質(zhì)解體變性巰基試劑防止蛋白質(zhì)或酶等（如輔酶）分子中基團(tuán)氧化成二硫鍵，在某些酶反應(yīng)過程中維持體系的還原環(huán)境。，、E基乙醇應(yīng)用最廣，谷胱甘肽也常應(yīng)用，由于他是生物體內(nèi)的還原劑，同時氧化后能被谷胱甘肽還原酶原位釋放。提取中，常使用巰基乙醇,維持緩沖液的還原環(huán)境，防止多酚類氧化，由于具有一定的毒性，濃度不應(yīng)高于％我2常見的船墊試劑皆于lit工作顒度Narm&MolecwlarM-olecullafSolubilityWorkingthrmula<g/lOOffiL20T：｝C4xncentralions半就址麒CjMtNSaU6二就罪醤醉l-immol/L134-251iSnunol/l.CjH^CtS7SJC與朋已由視落O.b2%(Wv)答吐甘肚ChHiiNAS本我引B眄nw山LA0fAX,0i<KScientificmiisher?r】即?巰基乙醇B巰基乙醇的主要作用是破壞 蛋白質(zhì)中的二硫鍵（肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基中的鍵）。還原蛋白質(zhì)二硫鍵，使 酶變性抑制酚類氧化，若氧化，核酸會變成灰黑色，苯酚的氧化產(chǎn)物苯醌等氧化物引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致和的交聯(lián)保護(hù)蛋白質(zhì)的巰基蛋白質(zhì)提取中需要巰基乙醇還原二硫鍵，使 酶失活化學(xué)變性劑、尿素、鹽酸胍能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力使蛋白質(zhì)變性但不影響肽鍵和二硫鍵，不能使蛋白質(zhì)徹底變性加上還原劑巰基乙醇或，能還原二硫鍵，使 徹底變性二硫蘇糖醇刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且 比巰基乙醇的濃度低倍時，兩者效果相近，但價格略高一些。由于容易被空氣氧化，因此 的穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著值的降低， 的有效還原性也隨之降低； 或含有的溶液不能進(jìn)行高壓處理。抑制 活性三甲酰乙基膦鹽酸鹽半胱氨酸苯酚、異硫氰酸胍、一羥基喹啉、B巰基乙醇等。 的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制 酶活性，因此 中還加入了一羥基喹啉、異硫氰酸胍、B巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源 （酶）。的一羥基喹啉可以抑制 ，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。B巰基乙醇的主要作用是破壞 蛋白質(zhì)中的二硫鍵。液氮組織破碎，裂解細(xì)胞十二烷基硫酸鈉陰離子去垢劑，高溫（ °C）裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，形成蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物，釋放核酸，提高鹽（或A濃度并降低溫度（冰?。?，使 蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}酸形式，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全、離心后除去沉淀，上清液中的 用酚氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的操作簡單，溫和，可提取到高分子量的，但產(chǎn)物多糖類雜質(zhì)較多陽離子強(qiáng)表面活性劑，通常與蛋白酶和抗氧化劑、螯合劑一起使用可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與 分離溶解膜類蛋白能裂解細(xì)胞。使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結(jié)合，陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵，使染色體離析，蛋白變性，釋放核酸。（） 是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)的疏水部位（） 可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變（） 是一種良好的解離劑，可使蛋白質(zhì)溶解，變性（）形成 蛋白質(zhì)復(fù)合物，并使復(fù)合物帶負(fù)電質(zhì)粒方面：在％的溶液中慢慢加入的，你會發(fā)現(xiàn)在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了的沉淀。但如果你加入的不是而是，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（ ）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（ ），而是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了中的納離子形成了不溶性的，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合,平均兩個氨基酸上結(jié)合一個分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組也一起被共沉淀了?；蚪M一旦發(fā)生斷裂，只要是一 大小的片斷，就沒有辦法再被共沉淀了:十六烷基三甲基溴乙胺，低溫時易沉淀陽離子去污劑一種在高鹽下能和核酸結(jié)合形成可溶、穩(wěn)定的復(fù)合物，低鹽濃度下可沉淀的表面活性劑是一種陽離子去污劑低離子強(qiáng)度（ 5,沉淀核酸與酸性多聚糖，而蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液中。在高離子強(qiáng)度的溶液中 ， 與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。可從大量產(chǎn)生黏多糖的植物及某些革蘭氏陰性菌制備純化的，這種去污劑加入調(diào)節(jié)至高離子強(qiáng)度的細(xì)菌和細(xì)胞裂解液中（＞ ）,經(jīng)過連續(xù)的酚氯仿抽提，去除黏多糖蛋白質(zhì)復(fù)合體，異丙醇無水乙醇沉淀上清即可將 分離出來還有提高互補鏈復(fù)性速率及穩(wěn)定已形成的雙螺旋的作用法的主要特點是用用較廣溶液在低于度會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料時，必須預(yù)熱，且離心溫度不低于度酶抑制劑，螯合二價金屬，抑制金屬依賴性的酶螯合 或離子，抑制細(xì)胞中 的活性，該酶可降解是去垢劑，結(jié)合離子用，而它結(jié)合的部分離子是能夠誘發(fā)或者促進(jìn)酶活性的，比如。 是一種二價離子熬合劑能熬合 和 等二價陽離子而多種酶的活性是需要依賴二價陽離子的所以 能通過熬合二價陽離子來抑制 酶的活性堿性條件下才能夠溶解，要和 粉末混合后，再加水，然后用 水溶液調(diào)節(jié)H, 酶基本失活。酶抑制劑，使一些降解酶的活性的表面變性精胺或其他多胺）酶抑制劑，降低核酸酶的影響）氰化物酶抑制劑，降低重金屬氧化酶的影響減少酚類、醌類、單寧類物質(zhì)的影響，抗氧化作用，絡(luò)合多酚和萜類物質(zhì)，防止多酚類褐變而氧化，去除多糖和色素，色素是 強(qiáng)抑制劑，必須去除樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入 或 等能絡(luò)合多酚和萜類物質(zhì)，離心或氯仿抽提出去，有效防止多酚氧化成醌類，避免溶液變褐色而具有抗氧化能力提取液中加入適量的或能提高 的純度，用量根據(jù)雜質(zhì)而定（）％同時能去除多糖，因此將 和巰基乙醇配合使用并調(diào)整用量，能有效防止多酚污染聚乙烯吡咯烷酮是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少 中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。之類的去垢劑有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，所以在 有很強(qiáng)的吸收。蛋白酶蛋白酶：切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使 分子完整地分離出來。蛋白酶在較廣的范圍內(nèi)均有活性（ ）溫度范圍 度鹽濃度或尿素中均有活性在一些去污劑： 、 和 條件下也有活性。蛋白酶消化裂解法適用于所有標(biāo)本的消化處理，尤以樣品為佳如組織細(xì)胞包括石蠟包埋組織絨毛、毛發(fā)、精斑、血液血清、血漿、全血局部分泌物、尿，糞便等蛋白酶的一般工作濃度是一UL蛋白酶蛋白酶或鏈酶蛋白酶可以降解蛋白質(zhì)滅活核酸酶 和和 也用于去除不需要的核酸，有人使用蛋白酶替代 處理水的,但有些人說效果不好。蛋白酶，威力巨大的廣譜蛋白酶， 加熱分鐘，則完全失活。數(shù)年前首次使用它替代 處理 抽提用的離心管和槍頭，效果不錯；后來又用于處理的水，效果也是一級棒。從此就再也不用 了。配制裂解試劑時，直接用滅菌的雙蒸水配制，最后，加入蛋白酶至終濃度 。輕輕混勻，室溫放置分鐘后即可。槍頭及離心管去除 ：先將槍頭及離心管清洗干凈后，移入預(yù)先混好的含 蛋白酶的雙蒸水，徹底浸入。室溫放置分鐘后，連水一起高壓滅菌。棄水后，烘干即可。水的獲得：直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶至終濃度 。輕輕混勻，室溫放置分鐘后，滅菌處理即可。該蛋白質(zhì)的殘留對后續(xù)實驗沒有可見的影響。無蛋白質(zhì)殘留的 水的獲得：這比較麻煩。直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶至終濃度 。輕輕混勻后，倒入專用的蒸餾器中。放置 分鐘后，加熱蒸餾，流出的就是無蛋白質(zhì)殘留的 水。要提醒的是，該專用蒸餾器頭幾次流出來的水,只能當(dāng)普通蒸餾水用，因為通道中難確保 的環(huán)境；另外，一定要主要密閉性,否則，流出的水又被污染了。配裂解液的作用是破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與 分離，抑制細(xì)胞中 的活性，而蛋白酶的作用是將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使 分子完整地分離出來！溶菌酶溶壁酶多糖水解酶：水解多糖飽和酚酚是一種有機(jī)溶劑預(yù)先要用緩沖液飽和因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)：故在制備酚飽和液時要加入羥基喹嚀以防止酚氧化。苯酚非極性分子水為極性分子使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了 的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與 聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而溶于水相。使用酚的優(yōu)點：有效變性蛋白質(zhì)； 抑制了 的降解作用。能有效使蛋白質(zhì)變性而出去，酚形成的有機(jī)相破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性，從而蛋白質(zhì)不會分布在水相中，避免核酸污染缺點： 能溶解 的水，從而溶解一部分 （） 。不能完全抑制 的活性。酚變性大，但與水相有一定程度的互溶，大約 的水溶在酚相中，使核酸損失酚（ n寸蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），應(yīng)此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。氯仿非極性分子水為極性分子去除脂肪,使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率克服酚的缺點；加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）氯仿變性不如酚好，但與水不混溶，不會帶走因此混合使用最佳，經(jīng)酚第一次抽提的水相有殘留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次帶走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例為1：1苯酚/氯仿苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)非極性分子水為極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c他們混合時，蛋白質(zhì)分子見的水分子被擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性，經(jīng)離心，變性蛋白密度比對大，而與水相分離，苯酚/氯仿比重大，保留在最下層苯酚氯仿使蛋白質(zhì)變性量要足夠，因為苯酚去除蛋白是有一定的飽和度的，超過飽和度，裂解體系中蛋白質(zhì)不能被一次性去除，必須多次抽提。離心后分三層，下層有機(jī)層中有一些脂溶性的雜質(zhì)，中間層白色絮狀沉淀是蛋白,上清液中即含有核酸;變性后的蛋白質(zhì)從水相中析出，位于苯酚中或苯酚與水相之間。異戊醇抽提，為混合均勻，容易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用，加入異戊醇降低分子表面張力，一般采用氯仿：異戊醇=2：41或酚：氯仿：異戊醇=2：524：1（不必先配置，臨用前加入即可）減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。提供一個高鹽環(huán)境，使 充分溶解于液相沉淀時總會加入高濃度的鹽加鹽的目的是破壞能使蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定的兩個因素使蛋白和分離并沉淀下來而此時鹽的陽離子會與結(jié)合形成陽離子鹽溶于溶液中再用無水乙醇可以將陽離子鹽沉淀下來提取 時先加 氯化鈉，因為在這種濃度的氯化鈉溶液中， 的溶解度最低，而蛋白質(zhì)的溶解度增加，這樣通過過濾能將 分離開，以除去蛋白質(zhì)。再加入的酒精能使 沉淀，因為在這個濃度下 溶解度最低。如果直接加酒精不先加氯化鈉，和蛋白質(zhì)都能被酒精所沉淀，就無法將 和蛋白質(zhì)分離開。所以必須先加氯化鈉后加酒精，順序不能顛倒。溶液是 以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去 周圍的水分子,使 失水而易于聚合。這樣可以是 沉淀出來在為左右的溶液中， 分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的 或，使中和 分子上的負(fù)電荷，減少分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成 鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分 形成鈉鹽而聚合，這樣就造成沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的 中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響 的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。檸檬酸鈉它可以控制反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，同時還有一定的緩沖作用，保證體系 的相對穩(wěn)定狀態(tài),總之檸檬酸鈉在這里的作用類似于食物中的防腐劑。焦碳酸二乙酯，它通過和 酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。與肝素何用效果增強(qiáng)。在 中不穩(wěn)定，很快會分解為二氧化碳和乙醇。強(qiáng)烈但不徹底的 酶抑制劑 濃度緩沖體系，使變化不會太大異丙酉孚加入異丙醇之后立即出現(xiàn)絮狀沉淀，我一直以為這是正確的，看了帖子才知道是蛋白質(zhì)污染，異丙醇的沉淀效果要比無水乙醇的沉淀效果要好，但是異丙醇沉淀有一個弊端就是會沉淀下來好多的鹽和蛋白質(zhì)這樣會影響下一步的操作，一般我加異丙醇是等體積的效果還可以。70乙%醇乙醇洗滌沉淀因為在乙醇里是不溶的而鹽離子卻可溶用無水乙醇則達(dá)不到這個目的!乙醇對于蛋白質(zhì)、核酸的沉淀效應(yīng)隨分子量加大而增大，小分子的核酸和蛋白質(zhì)碎片是可以溶于乙醇的。漂洗，是為了去除殘余的鹽類，去除過量和酚等雜物，因為在的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑避免對以后反應(yīng)的影響。（焦碳酸二乙酯）常用酶抑制劑，與 酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)