遺傳工程學(xué)備考

弟一章限制性核酸內(nèi)切酶(Restrictionendonuclease)：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核昔酸序列(4—8bp),并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。功能：自我保護(hù)作用限制(Restriction)：限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。修飾(Modification)：細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。限制性內(nèi)切酶的類型：I型限制性內(nèi)切酶、II型限制性內(nèi)切酶、III型限制性內(nèi)切酶粘性末端(stickyends,cohensiveends)：含有幾個(gè)核昔酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出；②3’端凸出同裂酶(Isoschizomers)：識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。同尾酶(Isocaudamers)：識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglII、BclI、XhoII等，同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識(shí)別。影響限制性內(nèi)切酶活性的因素.DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。如何解決？純化DNA；②加大酶的用量；③延長保溫時(shí)間；④擴(kuò)大反應(yīng)體積(>20叫)DNA的甲基化程度;溫度：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。緩沖液(Buffer):是影響限制酶活性的重要因素。星號(hào)(*)活性：Staractivity，高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象。EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTCM序列，但在甘油濃度超過5%(v/v)時(shí)，也可切割5,PuPuATPyPy3,或者5‘AATT3FO對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切；(2)對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切酶切程度：完全酶切；部分酶切應(yīng)采取的措施：減少酶量；縮短反應(yīng)時(shí)間；增大反應(yīng)體積DNA連接酶大腸桿菌連接酶：只能連接粘性末端。T4噬菌體的連接酶：不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。DNA連接酶連接條件：(1)必須是兩條雙鏈DNA。(2)DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)(P)。(3)需要能量影響連接反應(yīng)的因素：(1)插入片段與載體的濃度比例：3-10倍，增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。反應(yīng)溫度：12.5°。，一般14~16°C。提高平頭末端連接效率的方法包括：(1)加大連接酶用量(10倍大于粘性末端的連接)加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽離子(NaCl)，最終濃度150-200mMKlenowfragmentKlenowfragment的性質(zhì)：具有5’t3’聚合酶活性和3’t5’外切酶活性。(失去了5’t3’外切酶活性)。主要用途：①3’端補(bǔ)平:補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。②DNA3’末端標(biāo)記:在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。③cDNA第二鏈的合成堿性磷酸酶的特性:催化脫掉DNA(或RNA)5’端的磷酸根。堿性磷酸酶的功能：(1)防止線性化的載體分子自我連接，單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接，堿性磷酸酶去磷后OH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有占能與脫磷酸的

載體OH連接。同聚物加尾：給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。第二章基因工程載體載體（Vectors）：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體?；蚬こ讨休d體的功能：（1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。（2）為外源基因提供在受體細(xì)胞中復(fù)制能力或整合能力。（3）為外源基因提供在受體細(xì)胞中擴(kuò)增表達(dá)必需的條件?；蚬こ虒?duì)載體的要求：（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制。（2）有選擇性標(biāo)記。（3）有一段多克隆位點(diǎn)。外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制。（4）分子量小，拷貝數(shù)多。（5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。質(zhì)粒（plasmid）:是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀雙鏈的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNAo質(zhì)粒的基本特性：（1）質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性；（2）自主復(fù)制性；（3）不相容性；（4）攜帶特殊的遺傳標(biāo)記質(zhì)粒的不相容性：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群o質(zhì)粒的不相容性的分子機(jī)制：兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）；（2）具有抗菌素抗性基因，是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)：用來插入外源DNA片斷，且插入后不影響復(fù)制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。構(gòu)建質(zhì)粒載體的指導(dǎo)思想：（1）刪除不必要的DNA區(qū)域°（2）減少限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。（3）加入易于檢出的選擇性標(biāo)記，便于檢測(cè)含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞°（4）關(guān)于質(zhì)粒安全性能的改造°（5）改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。0-半乳糖苷酶X-gal顯色反應(yīng)：P-半乳糖昔酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。X-gal經(jīng)0-半乳糖昔酶分解產(chǎn)生半乳糖和5-漠-4-氯靛藍(lán)10.IPTG的誘導(dǎo)作用：IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’a肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生a肽！IPTG,異丙基-0-D-硫代半乳糖昔質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌0-半乳糖昔酶的缺失被載體產(chǎn)物a互補(bǔ)，能分解Xgalo質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌0-半乳糖昔酶的缺失被載體產(chǎn)物a互補(bǔ)，能分解Xgalo且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長穿梭質(zhì)粒載體(shuttleplasmidvectors):人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。分離的不穩(wěn)定性(segregationinstability):在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個(gè)細(xì)胞沒有獲得質(zhì)?？截悾⒆罱K繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性(structuralinstability):寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素新陳代謝負(fù)荷:①復(fù)制負(fù)荷;?轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷:使寄主細(xì)胞生長減緩,質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長約15%。減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體！質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)：是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。差度(variance)：每個(gè)菌體中所擁有的質(zhì)粒拷貝數(shù)不完全相同，稱差度。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。寄主菌的重組體系：含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。二聚體災(zāi)難(dimercatastrophe): 野生型E.col中，質(zhì)粒在寄主的重組酶作用下會(huì)發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。M13系列載體的優(yōu)點(diǎn)有MCS，便于克隆不同的酶切片段X-gal顯色反應(yīng)，可供直接選擇無包裝限制，克隆能力大可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈?zhǔn)删］d體(phagemidvectors):是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體。(1)噬菌粒載體的特點(diǎn):①分子量?、诳寺∧芰Υ螈蹆煞N復(fù)制形式，既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。cos位點(diǎn)(cohensive-endsite)：人DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。烈性噬菌體(virulentphage)：感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。溫和噬菌體(temperatephage)：感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中，成為它的一個(gè)組成部分。形成這一過程稱為溶源化(lysogenization)。原噬菌體(prophage)：整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。人DNA載體的優(yōu)點(diǎn)：①可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌②DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量③重組lDNA分子的篩選較為方便(4)重組lDNA分子的提取較為簡(jiǎn)便(5)lDNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件：(1)DNA復(fù)制起始點(diǎn)(ori)(2)著絲粒(centromere，cen)(3)兩個(gè)端粒(telomeres，tel)酵母人工染色體(YAC); 細(xì)菌人工染色體(BAC)第四章基因工程的主要技術(shù)增加PCR特異性的措施引物設(shè)計(jì)引物的退火溫度循環(huán)次數(shù)TaqDNA聚合酶，利用高保真DNA聚合酶降落PCR熱啟動(dòng)PCR巢式PCR巢式PCR(nestPCR):此時(shí)進(jìn)行二步PCR，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步不飽和PCR擴(kuò)增，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了提高PCR的產(chǎn)量外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。為了增加產(chǎn)物的特異性，設(shè)計(jì)2組引物(套嵌引物)，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間，進(jìn)行2輪擴(kuò)增。第一輪的PCR產(chǎn)物稀釋100-200倍作為下一輪的擴(kuò)增模板，進(jìn)行不飽和擴(kuò)增(10-15cycles)。熱啟動(dòng)PCR(hotstartPCR)降落PCR長片段PCR(long-rangePCR)6.不對(duì)稱PCR7.TAIL-PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR)第六章基因的重組與轉(zhuǎn)移1.粘性末端的連接：DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。2.齊平末端(bluntend)的連接包括直接連接和人工加尾形成“粘性末端”直接連接：5’端與3’端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。人工加尾形成“粘性末端”同聚加尾法原理：DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核昔酸。加尾一堿基互補(bǔ)：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核昔酸。優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來缺點(diǎn)：不能把插入片段再切下來。銜接物(linker)連接linker：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。linker的作用：用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。優(yōu)點(diǎn)：1)可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。2)能給載體連接上Polylinker缺點(diǎn)：如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段DNA接頭(adapter)連接法adapter：一頭平末端、另一頭粘性末端(某種酶切位點(diǎn)序列)。adapter的作用：用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。缺點(diǎn)：接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。防止自我連接：先用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。(以后再用T4多核昔酸激酶加上磷酸。)防止載體自身環(huán)化連接提高插入片斷的用量 連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多3倍以上。用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。影響轉(zhuǎn)化率的因素重組質(zhì)粒環(huán)形質(zhì)粒數(shù)：環(huán)形重組質(zhì)粒和質(zhì)粒自我連接，線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。感受態(tài)細(xì)胞(competentcells)生長狀態(tài)：制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長期的菌。必須在冰冷的條件下制備。CaCl2處理：要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70°C以下使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化：融化后一般不能再次凍存使用。體外包裝(invitpickaging)：把重組的噬菌體人DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的人噬菌體顆粒。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：通過受體菌細(xì)胞表面的人DNA接受器位點(diǎn)(receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。Ti質(zhì)粒：存在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)。2)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，環(huán)狀雙鏈DNA，1.5x105-2.0x105bp(185kb)

-T-DNA區(qū)域?細(xì)胞分裂素基因冠瘦堿合成右邊界-T-DNA區(qū)域?細(xì)胞分裂素基因冠瘦堿合成右邊界冠瘞堿代謝基因復(fù)制起始位點(diǎn)T-DNA(transferred-DNA)：轉(zhuǎn)移DNA,編碼冠癭堿的合成，能隨機(jī)整合到植物的染色體上。長度一般為12-24kb,是Ti質(zhì)粒最重要的部分。冠癭堿(opine)的作用：冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來的，是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠癭堿。毒性基因(vir)：決定土壤農(nóng)桿菌對(duì)植物的感染和T-DNA的轉(zhuǎn)移，進(jìn)入和整合。冠癭堿代謝基因：分別編碼代謝這兩種冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌生長。不相容性基因：控制川質(zhì)粒的不相容性。Ti質(zhì)粒的改造保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能部分(vir基因，左右邊界)。減少限制性酶切位點(diǎn)，引入單一插入位點(diǎn)。取消T-DNA的致瘤基因，使被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不再成為腫瘤，能正常分化。冠癭堿合成對(duì)于植物無意義。應(yīng)剔除掉。加入大腸桿菌的ori和選擇標(biāo)記。加上真核生物的轉(zhuǎn)錄信號(hào)和結(jié)束信號(hào)以及添加polyA的信號(hào)序列。農(nóng)桿菌的感染和生存第一步:植物受傷：植物受傷后能分泌酚類化合物(如乙酰丁香酮、 羥基乙酰丁香酮)，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的毒性基因表達(dá)。第二步感染植物：農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课?常在莖的基部)。第三步毒性基因(vir)表達(dá):virA、virG、virD、virB第四步T-DNA轉(zhuǎn)移：T-DNA被vir基因產(chǎn)物切下來，并運(yùn)送到植物細(xì)胞核里，整合到植物基因組中。第五步誘導(dǎo)冠癭瘤：T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過量的生長素和細(xì)胞分裂素，形成植物冠瘦瘤。第六步土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。雙元載體(binaryvectors)：既有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)也有農(nóng)桿菌復(fù)制起點(diǎn)，是個(gè)穿梭載體。①雙元載體的結(jié)構(gòu)：Ti質(zhì)粒被剔除了T-DNA、冠癭堿代謝基因、vir基因。大幅度減小質(zhì)粒的體積。nosnos終止子植物選擇標(biāo)記|nos啟動(dòng)了左邊界35S啟動(dòng)子-外源基因i插入?yún)^(qū)、\終止和加YpolyA雙元載體右邊界大腸桿菌。藥農(nóng)桿菌ori幫助質(zhì)粒(helperplasmid)：受體農(nóng)桿菌內(nèi)要求帶有整套vir基因(但缺失T-DNA及左右邊界)的“幫助質(zhì)粒”提供vir產(chǎn)物。Vir產(chǎn)物使雙元載體上的T-DNA左右邊界及其外源基因轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞，并整合到植物染色體上。顯微注射法(microinjection)：直接把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,ES)是從哺乳動(dòng)物早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass,ICM)中分離出來的一種二倍體細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)并保持全能分化的潛能，因此在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下它可形成胚系集落。插入型載體策略(O型載體策略)(InsertionType)插入型載體設(shè)計(jì)時(shí)，選擇基因在同源序列之外或之內(nèi)，導(dǎo)入宿主細(xì)胞前，需將打靶載體在同源區(qū)制造一個(gè)線性化缺口，這樣會(huì)使同源重組效率提高。插入型載體與靶基因在同源區(qū)發(fā)生一次單交換后，將造成整個(gè)載體插入染色體同源區(qū)，從而使同源序列增加一個(gè)拷貝?！按蛄司妥摺辈呗?HitandRunStrategy):將一個(gè)僅含選擇基因的載體與另一個(gè)無選擇基因的打靶載體同時(shí)轉(zhuǎn)染入ES細(xì)胞，然而標(biāo)記基因的整合效率比預(yù)期低得多，此外還存在標(biāo)記基因隨機(jī)插入基因組的現(xiàn)象。雙置換法(DoubleReplacement)：首先用第一個(gè)帶有hprt基因的打靶載體轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，用HAT培養(yǎng)基篩選同源重組子，然后用第二個(gè)僅含突變的同源序列的打靶載體轉(zhuǎn)染所得的hprt+ES細(xì)胞，突變序列將hprt基因置換出來，用6-TG培養(yǎng)基可以篩選出hprt細(xì)胞。而第一步獲得的hprt+ES細(xì)胞可以作為今后將不同的突變導(dǎo)入靶基因的基礎(chǔ)，篩選工作將大為減少?；虼虬屑夹g(shù)：是一種定向改變細(xì)胞或生物個(gè)體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。它的產(chǎn)生和發(fā)展建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上的。通過在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生的外源基因與核基因組目標(biāo)基因之間DNA同源重組，進(jìn)行單或雙交換，實(shí)現(xiàn)基因的插入或替換，能夠使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上，從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。感受態(tài)大腸桿菌的制備原理：Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌等)，1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，能允許外源DNA分子進(jìn)入，這種易于吸收外源DNA的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。制備過程：

E"a-I重懸21.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法培養(yǎng)大腸桿4菖離心收集菌QD&&&至04-0.5用冰冷的60mMCaCl2用冰冷的E"a-I重懸21.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法培養(yǎng)大腸桿4菖離心收集菌QD&&&至04-0.5用冰冷的60mMCaCl2用冰冷的60mMCaCl2重懸收集菌用冰冷的60mMCaCl;重懸分裝、70°C凍存轉(zhuǎn)化(transformation):大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。轉(zhuǎn)染(transfection):大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。第七章基因文庫的構(gòu)建基因文庫(genelibrary)將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫?；蛭膸鞓?gòu)建的一般步驟染色體DNA大片段的制備斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。①物理切割法：超聲波(300bp)或機(jī)械攪拌(8kb)。酶切法：內(nèi)切酶進(jìn)行局部消化，可得到10-30kb的隨機(jī)片段。載體與基因組DNA大片段的連接直接連接、人工接頭或同聚物加尾粘性末端直接連接：載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。②人工接頭發(fā)(adapter):人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片段。3.脈沖凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)在不改變其它如凝膠濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度和緩沖液的條件下，脈沖凝膠電泳使大分子DNA的分辨力提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到10Mb。基因組文庫的大?。阂粋€(gè)文庫要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。z?ln(l-p)?p:文庫包含了整個(gè)基因組DNA的概率(99%)f：插入載體的DNA片斷的平均長度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)(克隆數(shù))YAC文庫(YeastartificialchromosomesYACs)，利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。釀酒酵母的形態(tài)為扁圓形和卵形，生長的代時(shí)為90分鐘；含16條染色體，其大小為225-1900kb，總計(jì)有1.4x107bp；具真核mRNA的加工活性。YAC載體的復(fù)制元件端粒重復(fù)序列(telomericrepeat，TEL)：定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒(centromere，CEN)：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。自主復(fù)制序列(autonomouslyreplicationsequences,ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號(hào)。BAC文庫：指一種以F質(zhì)粒(F-plasmid)為基礎(chǔ)建構(gòu)而成的細(xì)菌染色體克隆載體，常用來克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb個(gè)堿基對(duì)。