第4章-核酸分子的酶切、連接和修飾課件

第四章核酸分子的酶切、連接和修飾第四章核酸分子的酶切、連接和修飾1第一節(jié)DNA分子的酶切一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制修飾系統(tǒng)（Restrictionmodificationsystem）是存在于細(xì)菌等一些原核生物體內(nèi)，可保護(hù)自身免于外來DNA（如噬菌體）侵入的一個系統(tǒng)，包括限制和修飾兩個方面的作用。第一節(jié)DNA分子的酶切一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restri2限制(Restriction)是指細(xì)菌的限制性核酸酶對入侵DNA的降解作用，這就限制了外源DNA侵入所造成的危害。修飾(Modification)是指細(xì)菌的修飾酶對于自身DNA堿基分子的甲基化等化學(xué)修飾作用，經(jīng)修飾酶修飾后的DNA分子可免遭細(xì)菌限制酶的降解作用。限制(Restriction)是指細(xì)菌的限制性核酸酶對32、限制性內(nèi)切酶的類型和命名Ⅰ型和Ⅲ型酶在基因工程研究中的應(yīng)用價值不大，通常所說的限制性內(nèi)切酶都是Ⅱ型酶。2、限制性內(nèi)切酶的類型和命名4表4-1三種限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)比較特征I型II型III型限制修飾活性單一多功能酶限制和修飾活性分開雙功能酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三種不同亞基單一成分兩種不同亞基限制作用的輔因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸切割位點(diǎn)距特異性位點(diǎn)1000bp外的位置隨機(jī)切割特異性位點(diǎn)或附近距特異性位點(diǎn)3’-端24—26bp位置甲基化作用位點(diǎn)特異性位點(diǎn)特異性位點(diǎn)特異性位點(diǎn)識別未甲基化位點(diǎn)進(jìn)行核酸內(nèi)切酶切割能能能序列特異性切割否是是在基因工程中應(yīng)用廣泛否是否表4-1三種限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)比較特征I型II型III5使用限制性內(nèi)切酶寄主菌的種屬名稱，來命名限制性內(nèi)切酶限制酶來源剪切方式EcoRIEscherichiacoliRY13G↓AATTCHindⅢHaemophilusinfluenzaeRdA↓AGCTT使用限制性內(nèi)切酶寄主菌的種屬名稱，來命名限制性內(nèi)切酶63、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的作用方式（1）識別并切割特異核苷酸序列（2）識別序列都是回文序列（3）切割后形成各種粘性末端或平整末端3、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的作用方式7圖4-1幾種Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的識別和切割序列圖4-1幾種Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的識別和切割序列8圖4-2雜交位點(diǎn)的形成及其切割圖4-2雜交位點(diǎn)的形成及其切割9二、限制性內(nèi)切酶切割DNA的方法（一）單酶切割DNA樣品二、限制性內(nèi)切酶切割DNA的方法（一）單酶切割DNA樣品10圖4-3單酶切割的DNA通過互補(bǔ)末端載體DNA的連接圖4-3單酶切割的DNA通過互補(bǔ)末端載體DNA的連接11圖4-4質(zhì)粒的圖譜及其酶切檢測結(jié)果圖4-4質(zhì)粒的圖譜及其酶切檢測結(jié)果12（二）雙酶或多酶切割DNA樣品（二）雙酶或多酶切割DNA樣品13圖4-5雙酶切割的DNA通過互補(bǔ)末端載體DNA的連接圖4-5雙酶切割的DNA通過互補(bǔ)末端載體DNA的連接14（三）DNA樣品的部分酶切圖4-6DNA樣品的部分消化（A）基因組DNA電泳；（B）基因組DNA部分酶切結(jié)果（三）DNA樣品的部分酶切圖4-6DNA樣品的部分消化15三、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1.DNA樣品純度2.DNA甲基化程度3.緩沖液條件4.酶切反應(yīng)溫度5.DNA分子結(jié)構(gòu)三、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素16四、DＮＡ酶切的應(yīng)用圖4-7

重組質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)例四、DＮＡ酶切的應(yīng)用圖4-7重組質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)例17第二節(jié)DNA分子的連接一、連接酶連接酶(Ligase）是一類能將兩個核酸片段連接起來的酶。目前已研究發(fā)現(xiàn)多種不同來源或作用于不同底物的連接酶類，這里主要介紹：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶、熱穩(wěn)定DNA連接酶和T4RNA連接酶。第二節(jié)DNA分子的連接一、連接酶18二、粘性末端DNA片段的連接（一）相同粘性末端的連接（二）不同粘性末端的連接二、粘性末端DNA片段的連接19三、平末端DNA片段的連接（一）平末端DNA片段的直接連接（二）同聚物加尾法（三）接頭連接四、影響連接反應(yīng)的因素三、平末端DNA片段的連接20圖4-8同聚物加尾連接示意圖圖4-8同聚物加尾連接示意圖21圖4-9利用接頭分子的連接示意圖圖4-9利用接頭分子的連接示意圖22第三節(jié)DNA分子的修飾一、DNA修飾酶1、末端轉(zhuǎn)移酶2、T4多聚核苷酸激酶3、堿性磷酸酶第三節(jié)DNA分子的修飾一、DNA修飾酶23二、T4多聚核苷酸激酶對DNA的修飾作用1、5’-OH末端磷酸化2、核酸分子5`-端的標(biāo)記三、堿性磷酸酶對DNA的修飾作用二、T4多聚核苷酸激酶對DNA的修飾作用24思考題1、什么是DNA限制性內(nèi)切酶；基因工程中常用的是哪種類型，如何命名？2、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶有哪三個主要的作用特性？3、請以表格比較并說明常用DNA聚合酶及其性質(zhì)。