CLSI臨床質(zhì)譜新標(biāo)準(zhǔn)解讀

CLSI臨床質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)C62-A內(nèi)容解讀CLSIC62-A主題內(nèi)容架構(gòu)由根底內(nèi)容局部包括〔1〕〔2〕標(biāo)準(zhǔn)預(yù)〔3〕〔4〕儀器；方法內(nèi)容包括〔5〕〔6〕〔7〕方法驗(yàn)證；質(zhì)控內(nèi)容包括〔8〕液質(zhì)檢驗(yàn)方法的質(zhì)量保證與質(zhì)量把握〔9〕后續(xù)監(jiān)視構(gòu)成。其中方法和質(zhì)控內(nèi)容是與應(yīng)用過程直接相關(guān)的。下面進(jìn)展具體介紹。預(yù)考察事項(xiàng)〔preexaminationconsiderations〕目標(biāo)分析物5.1.15.1.25.1.3外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的相關(guān)因素、5.1.4樣本采集。要充分了解目標(biāo)分析物的性質(zhì)，包含〔1〕目標(biāo)分析物的臨床意義如生理意義、臨床價(jià)值、常用檢測(cè)方法等〔〕3〕存在形式如游離型、結(jié)合型〔4〕干擾因素如類似物、同分異構(gòu)體、其他代謝產(chǎn)5〕6〕樣本類型如血清、血漿、全血、尿樣、唾液、膽汁、組織等〔〕采集和處理方式如靜脈血、足底血、指尖血、離心處理或靜置、何種采血管等〕儲(chǔ)存和運(yùn)輸方式如避光、冷藏、冷凍等。內(nèi)標(biāo)高定量分析的準(zhǔn)確性和周密度及方法穩(wěn)定性。試劑和耗材的質(zhì)量試劑盒耗材的質(zhì)量：由于MS靈敏度高，因此試劑和耗材要求也高。在使用前應(yīng)MSSOP進(jìn)展保存、ISO17025:2023進(jìn)展批間次管控。試驗(yàn)室設(shè)備：配置校準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)時(shí)，試驗(yàn)室應(yīng)使用A級(jí)的容量瓶和移液器。方法建立〔assaydevelopment〕離子轉(zhuǎn)變〔iontransition〕在建立和優(yōu)化質(zhì)譜采集參數(shù)的過程中源適合中等偏大極性化合物、難揮發(fā)化合物或熱不穩(wěn)定化合物；APCI源適合有確定揮發(fā)性以及質(zhì)譜掃描參數(shù)，使所選擇的離子對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)值最高。高效液相色譜固定相定相有C18、C8、苯基柱等，極性固定相有氨基柱、氰基柱、硅膠柱等。要留意色譜柱的耐壓范圍和pH使用范圍。當(dāng)更換色譜組時(shí)，應(yīng)使用系統(tǒng)適用性樣本〔SSS〕進(jìn)展核查。高效液相色譜流淌相流淌相的設(shè)計(jì)取決于目標(biāo)分析物的理化性質(zhì)和色譜柱的特性包括溶劑組成和比例、流速、離子強(qiáng)度、pH值、添加劑和溫度等。其中避開使用的添加劑有非揮發(fā)鹽、無機(jī)鹽〔腐蝕離子源、外表活性劑〔抑制電噴霧、離子對(duì)試劑〔影響后續(xù)離子化。進(jìn)展梯度洗脫或等度洗脫時(shí)，要留意溶劑比例、進(jìn)樣量、運(yùn)行時(shí)間、梯度范圍、柱溫、樣品溶劑等因素對(duì)分析結(jié)果的影響。應(yīng)明確標(biāo)注流淌相的有效期。參數(shù)考察〔examinationvariables〕保存時(shí)間把握流淌相、色譜柱及外部條件〔如溫度〕等。要預(yù)混合、防蒸發(fā)、把握pH值、保證泵流速。要求每次檢測(cè)保存時(shí)間變化在±2.5%內(nèi)。色譜區(qū)分率應(yīng)到達(dá)基線分別Rs>1.25?？梢酝ㄟ^增加色譜柱長(zhǎng)度、轉(zhuǎn)變流淌相組成和比例、減緩梯度、降低流速和提高柱溫來實(shí)現(xiàn)良好的色譜分別。其他改善色譜質(zhì)量的因素如使用保護(hù)柱、削減死體積、檢查管線連接到位等。信噪比LLMIS/N1020S/N的措施有考察基質(zhì)效應(yīng)、再優(yōu)化提取效率、離子源參數(shù)、洗脫梯度、重組溶液、進(jìn)樣體積，優(yōu)化駐留時(shí)間，優(yōu)化進(jìn)樣量，優(yōu)化前處理以及考慮衍生。色譜峰數(shù)據(jù)點(diǎn)和積分15-2010個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)展擬合。采集數(shù)據(jù)點(diǎn)的個(gè)數(shù)應(yīng)與駐留時(shí)間有關(guān)。承受正切斜滑〔tangentskim〕方式積分非基線分別色譜峰。誤差來源由基質(zhì)效應(yīng)引起生物樣本高度簡(jiǎn)潔，基質(zhì)組成一般包括鹽類、脂類、蛋白、多肽有機(jī)小分子等。鹽類、〔特別是磷脂色譜分別去除。碎片離子的穿插干擾假設(shè)兩個(gè)碎片離子有一樣的m/z，并且同時(shí)進(jìn)入碰撞室可能會(huì)發(fā)生干擾。篩等工程需要同時(shí)采集多離子通道信號(hào)時(shí)也可能會(huì)發(fā)生碎片離子干擾。駐留時(shí)間和切換通道時(shí)間極端〔<1ms〕時(shí)也易消滅碎片離子穿插干擾。內(nèi)調(diào)和校準(zhǔn)品的雜質(zhì)方法校準(zhǔn)〔assaycalibration〕概述校準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)應(yīng)具有確定的純度和穩(wěn)定性信息。只要可能，校準(zhǔn)物質(zhì)的定值應(yīng)溯源至參考方法〔ISO1751〔sCRMs可用于驗(yàn)證商業(yè)校準(zhǔn)品或試驗(yàn)室自配校準(zhǔn)品的定值，但是應(yīng)留意基質(zhì)效應(yīng)。物體液可作為抱負(fù)的基質(zhì)。對(duì)于內(nèi)源性分析物，推舉使用“模擬”基質(zhì)削減基質(zhì)效應(yīng)，經(jīng)透>20%LLMI則可使越相像越好。要時(shí)刻留意考察基質(zhì)效應(yīng)。校準(zhǔn)品的數(shù)量和位置FDA規(guī)定校準(zhǔn)應(yīng)包括空白、零點(diǎn)、6-8個(gè)濃度點(diǎn)〔建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際操作中，標(biāo)LLMI和ULMI，以及分析范圍內(nèi)的全部相關(guān)醫(yī)學(xué)打算水平點(diǎn)。弱標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍跨度超過3〔如10-100證檢測(cè)質(zhì)量，則可視具體狀況而定。生成曲線預(yù)驗(yàn)證〔preverification〕—評(píng)估根本性能參數(shù)選擇性和特異性第一步：進(jìn)展背景噪音評(píng)價(jià)。雙空白樣本〔/無內(nèi)標(biāo)〕反響LC/MS系統(tǒng)的LLMI處分析物峰面積的20%IS5%?；|(zhì)效應(yīng)的評(píng)估影響目標(biāo)分析物響應(yīng)的現(xiàn)象。C62~~一般指常規(guī)方LC-MS方法驗(yàn)證的重要一環(huán)。推舉方法為提取添加試驗(yàn)—前處理為液液萃取、蛋白沉淀等。其中set1含有待測(cè)物+內(nèi)2+3+〔樣本。set2/set1set3/set2set3/set1可以評(píng)估5〔基質(zhì)試驗(yàn)應(yīng)做5批，計(jì)算結(jié)果的平均值，每批包含5種不同的基質(zhì)〔樣本。結(jié)合a考慮，假設(shè)周密度>15%，需要重優(yōu)化方法，假設(shè)在一個(gè)樣品基質(zhì)中自方法的靈敏度和特異性不能滿足要求，需要重優(yōu)化方法。還有柱后灌注試驗(yàn)可直觀的評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)混合試驗(yàn)〔CLSIEP-07〕方法：混合含有目標(biāo)分析物的不同機(jī)制樣本〔通常為純?nèi)芤簶颖竞蜕锘|(zhì)樣本TFA，更換色譜柱，更換離子化方法如ESIAPCI，或者嘗試使用其他型號(hào)品牌的質(zhì)譜系統(tǒng)。穿插污染〔攜帶污染〕LC-MS尚無臨床指南設(shè)定LC-MS的允許殘留標(biāo)準(zhǔn)，但攜帶污染不應(yīng)對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性或周密度產(chǎn)生顯應(yīng)當(dāng)遠(yuǎn)低于〔如25。評(píng)級(jí)方法參見I0或A指南。假設(shè)攜帶污染大于序，流淌相組成。必要時(shí)，使用前鈍化色譜柱。初步周密度〔重復(fù)性〕評(píng)價(jià)〔多批次90%ULM〔。一批進(jìn)展20次重復(fù)測(cè)定。計(jì)算V和靶值回收率。假設(shè)不滿足預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，則要重優(yōu)化方法。LOD，LLMI，線性和稀釋，周密度，準(zhǔn)確度，干擾。方法建立〔assaydevelopment〕檢測(cè)限和定量檢測(cè)下限7.1.1LODLOD檢測(cè)限是指檢測(cè)方法在規(guī)定的試驗(yàn)條件下所能檢出分析物的最低濃度。僅用于關(guān)心LLMICLSIEP17。7.1.2LLMILLMI條件下所能準(zhǔn)確定量檢測(cè)分析物的最低濃度或最低量。承受LC-MS定量檢測(cè)時(shí)不建議報(bào)LLMI的檢測(cè)結(jié)果。線性與稀釋CLSIEP-06。推舉9-11點(diǎn)濃度，2-4次重復(fù)。避開逐級(jí)稀釋〔引入系統(tǒng)誤差。承受多元回歸方程〔如加權(quán)最小二乘法〕評(píng)價(jià)線性，記錄線性方程和相關(guān)系1515。會(huì)有三種稀釋狀況〔1〕定量范圍以內(nèi)稀釋如需要改善離子抑制或增加〔2定量范圍以外稀釋如當(dāng)分析物濃度大于I時(shí)應(yīng)進(jìn)展3LLMIIS濃〔3〕小體積樣本稀釋。小體積的樣本〔如嬰幼兒通常只能采到15~50μL的血清〕考慮不同病理生理狀態(tài)，稀釋終濃度至少大于3倍LLMI，如無法到達(dá)，應(yīng)有質(zhì)控措施〔一樣水平質(zhì)控。周密度CLSIEP-05，CLSIEP-15。用于評(píng)估方法的重復(fù)性〔批內(nèi)〕和再現(xiàn)性〔批間。周密度評(píng)價(jià)的是整個(gè)測(cè)定過程，包括樣本采集、保存、樣本前處理、質(zhì)譜檢測(cè)等。平25%。不滿足濃度要求時(shí)可以稀釋或添加，但要留意基質(zhì)效應(yīng)。要與臨床應(yīng)用親熱結(jié)合，考CV≤15%，LLMICV20%Tea，建議不超TEa/3。同時(shí)兼顧考慮生物學(xué)變異，臨床指南文件，地方標(biāo)準(zhǔn)等。檢測(cè)干擾CLSIEP-07。LC-MS仍可受到多種物質(zhì)的干擾，如藥物及其代謝物質(zhì)、關(guān)注同分異構(gòu)體或同位素的干擾〔方法建立的難點(diǎn)之一。在方法建立時(shí)，推舉使用含高濃度干擾物的臨床樣本進(jìn)展干擾評(píng)估I7。在日常工作中，要積存檢測(cè)方法建立和驗(yàn)證階段的數(shù)據(jù)，以及目標(biāo)人群樣本的可承受范圍。監(jiān)測(cè)定量、定性離子通道豐度比峰型、保存時(shí)間、分析與內(nèi)標(biāo)相對(duì)關(guān)系的全都性。正確度〔trueness〕三種方法：方法間比對(duì)、分析具有賦值的物質(zhì)、回收試驗(yàn)〔多重。使用樣本優(yōu)先次序?yàn)閷?shí)際病人樣本>混合病人樣本>血清基質(zhì)QC>水溶非生物溶液。依據(jù)生物學(xué)變異、臨床指導(dǎo)原則及當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)要求確定承受標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)展方法間比對(duì)時(shí)，最具有說服力的方案是與參考方法比對(duì)，選擇大于40個(gè)目標(biāo)人群〔differenc，bia果相關(guān)性不佳，這與免疫法特異性問題有關(guān)。代品評(píng)估正確度。測(cè)定有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，來源為NIST，JCTLMPT材3~52次。方法比對(duì)之前進(jìn)展〔預(yù)判。進(jìn)展過程中，添加量的標(biāo)準(zhǔn)品至指控樣本或病人樣本中，35個(gè)重復(fù)。液質(zhì)檢驗(yàn)方法的質(zhì)量保證與質(zhì)量把握S試驗(yàn)室質(zhì)量治理體系的關(guān)鍵要素是質(zhì)量保證〕和質(zhì)量把握。A要求監(jiān)測(cè)從樣本采集、結(jié)果檢測(cè)、結(jié)果報(bào)告到報(bào)告解釋的全過程。QC是LCMS檢測(cè)方法運(yùn)QC樣品應(yīng)與樣本經(jīng)過一樣前處理過程，使用一樣檢測(cè)方法。質(zhì)控物的選擇質(zhì)控品基質(zhì)選擇種基質(zhì)，必需考慮基質(zhì)與病人樣本的接近程度〔脂類、蛋白、藥物、透析、批間和批內(nèi)均勻性、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品分別獨(dú)立制備。質(zhì)控品的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)質(zhì)控品的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)是質(zhì)控品有效應(yīng)用的根本前提，要考察短期、長(zhǎng)期和凍融穩(wěn)定性。質(zhì)控品濃度和頻率濃度3LLMIULMI的四周。在LLMI或者醫(yī)學(xué)打算水平四周設(shè)置濃度有助于早期覺察失控。最小頻率動(dòng)態(tài)治理質(zhì)控頻率取決于方法學(xué)性能>5%樣本總數(shù)，最少6個(gè)質(zhì)控品〔3濃度*2次重復(fù)測(cè)定〕置于分析批的前、中、后。最低要求242個(gè)質(zhì)控。QA/QC樣本系統(tǒng)適用性測(cè)試樣本類型為非提取樣本，一般為分析物或內(nèi)標(biāo)的純?nèi)軇┤芤骸y(cè)定方法至少重復(fù)3次，棄去第一次結(jié)果。推舉重復(fù)7次〔參與9.2.空后或者當(dāng)系統(tǒng)平衡消滅問題時(shí)就行系統(tǒng)適用性測(cè)試，以確保檢測(cè)系統(tǒng)處于正常狀態(tài)。雙空白和單空白雙空白：在采集的離子通道上無峰或峰面積<20%LLMI。ISIS對(duì)分析物峰面積的影響，要求<20%LLMI。指控可承受標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)估供給的可承受標(biāo)準(zhǔn)使用前應(yīng)進(jìn)展驗(yàn)證。失控時(shí)的訂正措施全部失控和訂正措施均應(yīng)記錄。要監(jiān)控包括數(shù)據(jù)類和圖形類參數(shù)。多工程、多重檢測(cè)的質(zhì)控策略每個(gè)分析物分別設(shè)定質(zhì)控參數(shù)。主要考慮分析物之間的關(guān)聯(lián)性。周期性質(zhì)控程序〔ISO17025〕6個(gè)月校正一次或按廠家推舉進(jìn)展質(zhì)譜的質(zhì)量校準(zhǔn)/3個(gè)月做一PPGLC/MS6個(gè)月檢查一次各系統(tǒng)間的相關(guān)性。換色譜柱時(shí)序言進(jìn)展驗(yàn)證。QC、校準(zhǔn)品、試劑、流淌相的批次更換，試驗(yàn)室可視狀況證打算。其他質(zhì)量保證因素對(duì)樣本進(jìn)展追蹤。對(duì)每一份樣本貼上帶有可追蹤信息及編碼的標(biāo)簽，與記錄對(duì)應(yīng)。實(shí)施后監(jiān)測(cè)力氣驗(yàn)證參與EQA打算，評(píng)價(jià)試驗(yàn)室檢