電泳技術和常用電泳儀課件

第六章電泳技術和常用電泳儀第六章電泳技術和常用電泳儀1第六章電泳技術和常用電泳儀

一、概述generalization)電泳（electrophoresis）是指帶電荷的溶質或粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。利用電泳現(xiàn)象將多組分物質分離、分析的技術叫做電泳技術（electrophoresistechnique）。可以實現(xiàn)電泳分離技術的儀器稱之為電泳儀（electrophoresister）。

第六章電泳技術和常用電泳儀一、概述ge2第六章電泳技術和常用電泳儀

目前，電泳技術已廣泛用于蛋白質、多肽、氨基酸、核苷酸、無機離子等成份的分離和鑒定，甚至還用于細胞與病毒的研究。臨床常用的電泳分析方法主要有醋酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和毛細管電泳等。

第六章電泳技術和常用電泳儀目前，電泳3第一節(jié)電泳原理

一、電泳的基本原理物質分子在正常情況下一般不帶電，即所帶正負電荷量相等，故不顯示帶電性。但是在一定的物理作用或化學反應條件下，某些物質分子會成為帶電的離子（或粒子），不同的物質，由于其帶電性質、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，因此可使它們分離。06-01電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。第一節(jié)電泳原理一、電泳的基本原理06-04第一節(jié)電泳原理若將帶凈電荷Q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為：F引=EQ（6-1）在溶液中,運動粒子與溶液之間存在阻力F阻F阻=6πrηV（6-2）當F引=F阻時EQ=6πrηVV=EQ/6πrη（6-3）由上式可以看出,粒子的移動速度(泳動速度V)與電場強度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。第一節(jié)電泳原理若將帶凈電荷Q的粒子放5第一節(jié)電泳原理

二、影響電泳的外界因素（一）電場強度

（二）溶液的pH值（三）溶液的離子強度（四）電滲作用（五）粒子的遷移率（六）吸附作用第一節(jié)電泳原理6第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法一、電泳技術的分類（一）根據(jù)工作原理的不同：可分為移界電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳、等電聚焦電泳、免疫電泳等。（二）根據(jù)有無固體支持物可分為：自由電泳和支持物電泳第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法一、電泳技術的分類7第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（三）根據(jù)支持載體的位置或形狀可分成：水平電泳、垂直電泳、板狀電泳、柱狀電泳、U型管電泳、倒V字形電泳、毛細管電泳等。（四）根據(jù)支持物的特點又可分為：①無阻滯支持物電泳。②高密度的凝膠電泳。（五）根據(jù)電源控制的不同，一般可分為以下3類：1.恒壓電泳;2.恒流電泳;3.恒功率電泳。第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（三）根據(jù)支持載體的位置或形狀8第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（六）根據(jù)自動化程度的不同，可分為半自動和全自動型。（七）根據(jù)其功能的不同，可分為制備型、分析型、轉移型、濃縮型等。（八）根據(jù)用法的類型可分為：雙向電泳、交叉電泳、連續(xù)紙電泳、電泳－層析相結合技術等。（九）根據(jù)不同的使用目的可分為：核酸電泳、血清蛋白電泳、制備電泳、DNA測序電泳等。第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（六）根據(jù)自動化程度的不同9第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法二、電泳方法簡介

（一）紙電泳指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。

06-02平臥式電泳槽裝置示意圖將濾紙條水平地架設在兩個裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點于濾紙中央。當濾紙條被緩沖液潤濕后，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸入直流電壓（100V～1000V）進行電泳。

第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法二、電泳方法簡介10第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（二）醋酸纖維素薄膜電泳電泳時經(jīng)過膜的預處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點是分離速度快、電泳時間短、樣品用量少。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。

06-03血清蛋白的電泳圖譜

第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（二）醋酸纖維素薄膜電泳011第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（三）凝膠電泳

由區(qū)帶電泳中派生出一種用凝膠物質作支持物進行電泳的方式，被稱為凝膠電泳。普通的凝膠電泳在板上進行，以凝膠作為介質。電泳中常用的凝膠為葡聚糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖。它具有機械強度好、彈性大、透明、化學穩(wěn)定性高、無電滲作用、設備簡單、樣品量小

(1～100μg）、分辨率高等優(yōu)點。

06-04凝膠電泳圖第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（三）凝膠電泳012第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（四）等電聚焦電泳1．等電聚焦電泳過程

一種利用有pH值梯度的介質，分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。

將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH值梯度的凝膠介質中，在電場內(nèi)經(jīng)過一段時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH值位置上，最后，樣品的各組分在各自的等電點聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。

06-05凈電荷與PH的關系曲線

第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（四）等電聚焦電泳將等13第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法2．等電聚焦電泳的特點①使用兩性載體電解質，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度；②由于“聚焦效應”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；③電泳速度快;④分辨率高;⑤加入樣品的位置可任意選擇；⑥可用于測定蛋白質類物質的等電點;⑦適用于中、大分子量（如蛋白質、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法2．等電聚焦電泳的特14第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（五）等速電泳采用兩種不同濃度的電解質組成，一種為前導電解質，充滿整個毛細管柱；另一種為尾隨電解質，置于一端的電泳槽中。前導電解質的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強電場的作用下，各被分離組分在前導電解質與尾隨電解質之間的空隙中移動，實現(xiàn)分離。06-06

等速電泳示意圖

第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（五）等速電泳采用兩種不同15第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（六）雙向凝膠電泳（二維電泳）第一向采用等電聚焦根據(jù)復雜的蛋白質成分中各個蛋白質的PI的不同，將蛋白質進行分離。第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）就是按蛋白質分子量的大小使其在垂直方向進行分離。其結果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點狀。第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法（六）雙向凝膠電泳（二維電泳）16第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法膠性PH9中電加解入質了溶雙液

PH3加上電場后建立穩(wěn)定PH梯度蛋白質溶液加入，建立電場染色后，蛋白質因PI值不同，沿PH梯度分離開第一向等電聚焦PI逐漸降低等電聚焦膠放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠上

第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量逐漸降低PI逐漸降低

06-07雙向凝膠電泳示意圖第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法膠性PH9加上電場17第二節(jié)常用電泳技術和電泳方法(七）免

(疫)(役)電泳

免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴散兩種方法的結合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開，然后加入抗體做雙相免疫擴散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴散而相遇，在二者比例適當?shù)牡胤?，形成肉眼可見的沉淀弧。第二?jié)常用電泳技術和電泳方法(七）免(疫)(役)電泳18第三節(jié)常用電泳設備的基本結構及技術指標一、常用電泳設備的基本結構（一）電泳電源（二）電泳槽（三）附加裝置06-08平臥式電泳槽裝置示意圖第三節(jié)常用電泳設備的基本結構及技術指標一、常用電泳設備19第三節(jié)常用電泳設備的基本結構及技術指標二、電泳儀的主要技術指標1．輸出電壓8．連續(xù)工作時間2．輸出電流9．保護措施3．輸出功率10．顯示方式4．電壓穩(wěn)定度11．定時方式5．電流穩(wěn)定度12．電源電壓6．功率穩(wěn)定度13．電源頻率7．輸出組數(shù)14．功耗

第三節(jié)常用電泳設備的基本結構及技術指標二、電泳儀的主要20第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式一、毛細管電泳的相關概念1.電場強度（ElectricFieldStrength）2.電泳淌度(ElectrophoreticMobility)3.遷移時間（MigrationTime）4.電泳速度(ElectrophoreticVelocity)5.電滲流（ElectroosmoticFlow，EOF）6.焦耳熱（JouleHeating）

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式一、毛細管電泳的相21第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式二、毛細管電泳的基本工作原理溶液中的帶電粒子以高壓電場為驅動力，沿毛細管通道，以不同速度向與其所帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離。第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式二、毛細22第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式06-09毛細管電泳儀裝置示意圖

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式06-023第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式三、毛細管電泳的特點1.高靈敏度2.高速度3.高分辨率4.樣品少5.自動化程度高6.應用范圍廣

06-10

英特雷勃——全自動電泳儀第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式三、毛細管電泳的特24第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式四、毛細管電泳的分離模式（一）毛細管區(qū)帶電泳

它是通過在充滿電解質溶液的毛細管中，不同質荷比大小的組分在電場的作用下，依遷移速度的不同而進行分離的。根據(jù)組分的遷移時間進行定性，根據(jù)電泳峰的峰面積或峰高進行定量分析。

06-11毛細血管區(qū)帶電泳原理圖

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式四、毛細管電泳的分25第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（二）毛細管凝膠電泳將板上的凝膠移到毛細管中作支持物進行的電泳。凝膠具有多孔性，起類似分子篩的作用，能根據(jù)待測組分的質荷比和分子體積的不同而進行分離。適用于分離、測定肽類、蛋白質、DNA類物質的分離。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（二）毛細管凝膠電26第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（三）毛細管膠束電動色譜(MECC)使MECC系統(tǒng)中存在兩個相：流動的水相和起到固定相作用的膠束相。在含有膠束的流動相中，溶質在“水相”和“膠束相”(準固定相)之間進行分配，即使是中性溶質，因其本身疏水性不同，在二者之間的分配也會有差異，疏水性強的溶質在“膠束相”中停留時間長，遷移速度就慢。反之，親水性強的溶質遷移速度就快，最終中性溶質將依其疏水性不同而得以分離。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（三）毛細管膠束電27第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式06-12毛細管膠束電動色譜原理圖第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式06-12毛細管膠28第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（四）毛細管等電聚焦電泳不同等電點的分子分別聚集在不同的位置上，不作遷移而彼此分離，這就是等電聚焦分離過程。毛細管的等電聚焦是在毛細管內(nèi)實現(xiàn)的等電聚焦過程，具有極高的分辨率，通?？梢苑蛛x等電點差異小于0.01pH單位的兩種蛋白質，例如肽類、蛋白質的分離。第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（四）毛細管等電聚29第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（五）毛細管等速電泳毛細管內(nèi)首先導入具有比被分離各組分高電泳淌度的前導電解質，然后進樣，隨后再導入比各分離組份低電泳淌度的尾隨電解質，在強電場的作用下，各被分離組分在前導電解質與尾隨電解質之間的空隙中發(fā)生分離。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（五）毛細管等速電30第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（六）毛細管電色譜它包含了電泳和色譜兩種機制，是在毛細管中填充或在毛細管壁上鍵合（或涂壁）固定相，從而構成毛細管色譜柱，依靠電滲流推動流動相，攜帶樣品遷移，根據(jù)樣品分子的質荷比、分子尺寸及分配系數(shù)的差別而分離。

06-13

CEC-加壓毛細管電色譜儀第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（六）毛細管電31第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式五、毛細管電泳儀的基本結構毛細管電泳儀的結構并不復雜，主要有高壓源、毛細管柱、檢測器，以及兩個供毛細管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液槽。

（一）毛細管柱（二）檢測器（三）毛細管電泳法的進樣技術

06-14毛細管電泳儀第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式五、毛細管電泳儀的32第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式

六、常用各種電泳儀簡介（一）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀是中壓電泳儀。其輸出電壓的調(diào)節(jié)范圍為0V～600V、輸出電流為0mA～100mA。該機工作穩(wěn)定性好、調(diào)節(jié)范圍寬，并設有完善的短路保護電路和過流保護電路，是目前國內(nèi)中、低壓電泳實驗中應用最廣泛的電泳儀之一。

06-15穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式六、常用各種電33第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（二）全自動醋纖膜電泳儀全自動醋纖膜電泳儀為全自動電泳儀，有可見光單系統(tǒng)，使用醋酸纖維薄膜電泳片，優(yōu)點為自動化程度高。只需將樣品、試劑、電泳片放好，人員可離機完成實驗并得到結果。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（二）全自動醋纖膜34第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（三）全自動熒光/可見光雙系統(tǒng)電泳儀全自動熒光/可見光雙系統(tǒng)電泳儀為全自動電泳儀，具有熒光/可見光雙系統(tǒng)，在使用熒光試劑項目如CK、LD同工酶時為全自動。只需將樣品、試劑、瓊脂糖凝膠電泳膠片放好后，操作人員可離機完成實驗并得到結果。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（三）全自動熒光/35第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（四）全自動瓊脂糖電泳儀全自動電泳儀，有可見光單系統(tǒng)，使用瓊脂糖凝膠電泳膠片，優(yōu)點為靈敏度高，可適用于低濃度蛋白檢驗。該儀器自動化程度較差，當電泳結束和染色脫色完成后，工作人員必須將電泳片由機器中取出。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（四）全自動瓊脂糖36第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（五）雙向電泳及雙向電泳-液相色譜-質譜聯(lián)用雙向電泳是將樣品進行電泳后，在它的直角方向再進行一次電泳。雙向電泳第一向為等電聚焦，第二向為梯度SDS電泳。樣品經(jīng)過電荷與質量兩次分離后可得到分子的等電點、分子量等信息。這是目前所有電泳技術中分辨率最高，信息量最多的技術，已成為分析復雜蛋白混合物的基本工具。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（五）雙向電泳及雙37第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（六）高效毛細管電泳及高效毛細管電泳-質譜聯(lián)用高效毛細管電泳是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為推動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。高效毛細管電泳是一種迅速發(fā)展的分離技術，儀器簡單、操作簡便、分析速度快、分離效率高、操作模式多、開發(fā)分析方法容易、實驗成本低、消耗少、應用范圍極廣。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（六）高效毛細管電38第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（七）毛細管電泳芯片利用毛細管電泳芯片可以進行DNA長度分析、序列分析和基因分型等研究。是利用芯片分離熒光標記的寡核苷酸，整個分離過程在45s之內(nèi)，而芯片的長度僅為3.8cm。因為其可承載高電壓（2300V/cm）并具有較小的樣品體積，故有利于得到較好的分離效果。

第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（七）毛細管電泳芯39第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（八）DNA測序系統(tǒng)

該系統(tǒng)利用凝膠毛細管的原理，將多道毛細管陣列設計，用四種不同的熒光染色標記4種核苷酸，在模板上合成DNA單鏈，然后在DNA外切酶的作用下進行堿基的連續(xù)水解和釋放，用激光識別和記錄釋放的堿基。

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DNA測序系統(tǒng)第四節(jié)毛細管電泳的基本結構和分離模式（八）DNA測序系40第五節(jié)電泳儀的臨床應用一、血清蛋白電泳

新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后，通?？梢?條帶，即清蛋白、1、2、和球蛋白。許多疾病總血清蛋白濃度和各蛋白組分的比例有所改變，通過血清蛋白電泳圖譜能幫助我們對某些疾病進行診斷及鑒別診斷。

06-17血清蛋白電泳圖譜第五節(jié)電泳儀的臨床應用一、血清蛋白電泳0641第五節(jié)電泳儀的臨床應用二、尿蛋白電泳臨床進行尿蛋白電泳的主要目的是：①確定尿蛋白的來源；②了解腎臟病變的嚴重程度（選擇性蛋白尿與非選擇性蛋白尿），從而有助于診斷和預后的判斷。當不能進行腎活檢時，尿蛋白電泳結果能很好地協(xié)助臨床判