分子標(biāo)記輔助育種課件

第十六章分子標(biāo)記輔助選擇育種

第一節(jié)分子標(biāo)記的類型和作用原理

第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第三節(jié)作物MAS育種第十六章分子標(biāo)記輔助選擇育種第一節(jié)分子標(biāo)記的類型和作1DNARNAProteinPhenotype育種工作的關(guān)鍵：如何提高選擇效率傳統(tǒng)育種一般是首先通過各種途徑創(chuàng)造遺傳變異，然后從分離群體的后代中進(jìn)行優(yōu)化選擇和評價(jià)，這種選擇是建立在植株的表現(xiàn)型基礎(chǔ)之上的，這就要求育種家必須具有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，而且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。作物的許多重要農(nóng)藝性狀為數(shù)量性狀，或?yàn)槎嗷蚩刂频馁|(zhì)量性狀為表型難以準(zhǔn)確鑒定的性狀。此時(shí)根據(jù)表現(xiàn)型來對性狀進(jìn)行評價(jià)是不確切的，因而選擇是低效的。DNA育種工作的關(guān)鍵：如何提高選擇效率傳統(tǒng)育種一般是首先通過2遺傳標(biāo)記：可以穩(wěn)定遺傳的，易于識別的特殊的遺傳多態(tài)性形式。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變（差）異；在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異或者是DNA序列的差異。遺傳標(biāo)記：可以穩(wěn)定遺傳的，易于識別的特殊的遺傳多態(tài)性形式。在3形態(tài)標(biāo)記(morphologicalmarkers)：

指植物的外部形態(tài)特征，如矮稈、白化、黃化、變態(tài)葉、雄性不育等。形態(tài)標(biāo)記(morphologicalmarkers)：4分子標(biāo)記輔助育種ppt課件5不足（1）數(shù)量有限，而人工培育形態(tài)標(biāo)記材料的周期長；（2）一些形態(tài)標(biāo)記的多態(tài)性差，易受環(huán)境因素的影響；（3）一些形態(tài)標(biāo)記對植株的表型影響太大，與不良性狀連鎖不足6細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cytologicalmarkers)

細(xì)胞內(nèi)染色體的變化，包括染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)的變異可通過染色體核型（染色體數(shù)目、大小、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C、N、G帶等）分析來測定基因所在的染色體及相對位置，或通過染色體代換等遺傳操作來進(jìn)行基因定位。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cytologicalmarkers)7CytogeneticMapping（1）采用染色體染色的方法區(qū)分染色體異染色質(zhì)和常染色質(zhì)、染色體長短、臂比、中心粒位置等等進(jìn)行染色體分型。為了顯示染色體的結(jié)構(gòu)改變，從60年代起建立了一系列染色體顯帶技術(shù)，包括Q、G、C、R、T帶分析等。其中應(yīng)用最廣的是G顯帶技術(shù)。為了進(jìn)一步提高分辨率，后來又建立了高分辨G顯帶技術(shù)，可把染色體的細(xì)微變化精確地定位到某一特定染色體的某一區(qū)帶上。CytogeneticMapping（1）采用染色體染色的8Cytogenetic

Mapping（2）細(xì)胞遺傳學(xué)基因定位示意圖，從圖中可以看出，不同基因定位于染色體不同位置上。這種結(jié)果僅僅是粗略的定位，顯示的是基因在染色體上的物理定位。Cytogenetic

Mapping（2）細(xì)胞遺傳學(xué)基因定9CytogeneticMapping（3）采用熒光染色體原位雜交的方法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)遺傳學(xué)定位圖示：不同的探針采用不同的熒光標(biāo)記，從而可以進(jìn)行熒光定位分析。CytogeneticMapping（3）采用熒光染色體原10不足（1）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記材料的選育需要花費(fèi)大量的人力和較長的時(shí)間；（2）某些物種對染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異反應(yīng)敏感或適應(yīng)變異的能力差而難以獲得這類標(biāo)記；（3）一些不涉及染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)變異或帶型變異的性狀則難以用細(xì)胞學(xué)方法檢測；不足（1）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記材料的選育需要花費(fèi)大量的人力和較長的時(shí)間11生化標(biāo)記(biochemicalmarkers)

利用基因的表達(dá)產(chǎn)物，主要包括貯藏蛋白、同工酶（具有同一底物專一性的不同分子形式的酶）和等位酶（由一個(gè)位點(diǎn)的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同）等，可以直接反映基因表達(dá)產(chǎn)物的差異，受環(huán)境的影響較小。不足：標(biāo)記數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際的需要;存在組織和器官特異性。生化標(biāo)記(biochemicalmarkers)12分子標(biāo)記輔助育種ppt課件13分子標(biāo)記輔助育種ppt課件14特點(diǎn)（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，表現(xiàn)穩(wěn)定。（2）數(shù)量多（理論上遍及整個(gè)基因組）（3）多態(tài)性高（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。（6）成本不太高目前已在作物遺傳圖譜構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記定位、種質(zhì)資源的遺傳多樣性與品種指紋圖譜及純度鑒定等方面得到廣泛應(yīng)用。特點(diǎn)目前已在作物遺傳圖譜構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記定位、種15顯性標(biāo)記(dominantmarkers)：指F1的多態(tài)性片段與其親本之一完全相同。如RAPD、AFLP、ISSR等。共顯性標(biāo)記(co-dominantmarkers)：指雙親的兩個(gè)以上分子量不同的多態(tài)性片段均在F1中表現(xiàn)。如RFLP、SSR、SCAR等。F1P1P2F1P1P2顯性標(biāo)記(dominantmarkers)：指F1的多態(tài)性16一、分子標(biāo)記的類型和特點(diǎn)分子標(biāo)記以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)（RFLP標(biāo)記）以PCR技術(shù)為核心的DNA標(biāo)記技術(shù)（RAPD標(biāo)記、SSR標(biāo)記、SSLP標(biāo)記、SCAR標(biāo)記、AFLP標(biāo)記、STS標(biāo)記）以測序?yàn)榛A(chǔ)的新型的分子標(biāo)記（SNP標(biāo)記、EST標(biāo)記）

第一節(jié)分子標(biāo)記的類型和作用原理一、分子標(biāo)記的類型和特點(diǎn)分以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)（17標(biāo)記名稱RFLPRAPDAFLPSSRISSRSCARSTSCAPs主要原理限制酶切Southern雜交隨機(jī)PCR擴(kuò)增限制性酶切結(jié)合PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增隨機(jī)PCR擴(kuò)增特異PCR擴(kuò)增特異PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物限制性酶切多態(tài)性水平中等較高非常高高高中等檢測基因組區(qū)域單/低拷貝區(qū)整個(gè)基因組整個(gè)基因組重復(fù)序列重復(fù)序列間隔的單拷貝區(qū)整個(gè)基因組單拷貝區(qū)整個(gè)基因組可靠性高中高高高高高高遺傳特性共顯性顯性/共顯性共顯性/顯性共顯性顯性/共顯性共顯性顯性/共顯性共顯性DNA質(zhì)量要求高，5-30μg中，10-100ng很高，50-100ng中，10-100ng中，2-50ng中，5-10ng高，50-100ng實(shí)驗(yàn)周期長短較長短短短短短開發(fā)成本高低高高低高高高標(biāo)記名稱RFLPRAPDAFLPSSRISSRSCARSTS18二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(一)RFLP（限制性片斷長度多態(tài)性）標(biāo)記

特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。通過電泳的方法分離和檢測這些片段。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。1、RFLP標(biāo)記原理二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(一)RFLP（限制性片斷長度多19分子標(biāo)記輔助育種ppt課件20ABAB限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與放射性探針結(jié)合部位①限制性內(nèi)切酶酶切后；②電泳分離DNA片段；③轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；④與放射性探針Southern雜交⑤放射性自顯影或酶學(xué)檢測分析陽性條帶?？娠@示出不同材料對該探針的限制性片段多態(tài)性情況。1、RFLP標(biāo)記原理ABAB限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與放射性探針①限制性內(nèi)切酶酶切后；121分子標(biāo)記輔助育種ppt課件22（1）遍布于整個(gè)基因組，數(shù)量幾乎是無限的；（2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠；（5）DNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。2、RFLP標(biāo)記的特點(diǎn)（1）遍布于整個(gè)基因組，數(shù)量幾乎是無限的；2、RFLP標(biāo)記的23第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction，PCR反應(yīng)）為基礎(chǔ)的各種DNA指紋技術(shù)。第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechain24PCR技術(shù)的原理1.變性：在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性。2.退火：是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNA片段。3.延伸：從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈。PCR技術(shù)的原理25分子標(biāo)記輔助育種ppt課件26二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(二)RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）標(biāo)記Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致。RAPD標(biāo)記技術(shù)就是用一個(gè)（有時(shí)用兩個(gè)）隨機(jī)引物（一般8-10個(gè)堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(二)RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性D27primerABC1、RAPD標(biāo)記原理primerABC28（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性）不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低；（5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。RAPD標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)條件摸索和引物的選擇是十分關(guān)鍵而艱巨的工作。只要實(shí)驗(yàn)條件標(biāo)準(zhǔn)化，可以提高RAPD標(biāo)記的再現(xiàn)性。2、RAPD標(biāo)記的特點(diǎn)（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；2、RAP29二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(三)AFLP（擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性）標(biāo)記AFLP即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，是1993年由Marc和Pieter發(fā)明創(chuàng)造的一種DNA分子標(biāo)記。該技術(shù)是對限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增，又稱基于PCR的RFLP。鑒于AFLP標(biāo)記的多態(tài)性強(qiáng)，一次可檢測到100~150個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，因而非常適合繪制品種指紋圖譜及進(jìn)行分類研究。二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(三)AFLP（擴(kuò)增片斷長度多態(tài)301、AFLP標(biāo)記原理對基因組DNA進(jìn)行雙酶切，在使用的兩種限制性酶中，一種為酶切識別位點(diǎn)為4堿基的酶，另一種為識別位點(diǎn)為6堿基的酶。進(jìn)一步將酶切片段和含有與其粘性末端相同的人工接頭連接，連接后的接頭序列及臨近內(nèi)切酶識別位點(diǎn)就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)，通過選擇在末端上分別添加1~3個(gè)選擇性堿基的不同引物，選擇性地識別具有特異配對順序的酶切片段與之結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，最后用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。1、AFLP標(biāo)記原理對基因組DNA進(jìn)行雙酶切，在使用的兩種限31分子標(biāo)記輔助育種ppt課件322、AFLP標(biāo)記的特點(diǎn)

（1）結(jié)合了PFLP穩(wěn)定性和PCR技術(shù)高效性的特點(diǎn)，不需要事先知道DNA序列的信息，可以用于任何動植物基因組的研究。（2）多態(tài)性豐富（3）標(biāo)記多數(shù)具有共顯性表達(dá)，無復(fù)等位效應(yīng)，表現(xiàn)孟德爾方式遺傳。（4）分析成本較高，對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求也較高。2、AFLP標(biāo)記的特點(diǎn)（1）結(jié)合了PFLP穩(wěn)定性和PCR技術(shù)33二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(四)SSR（簡單重復(fù)序列）標(biāo)記又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satelliteDNA)標(biāo)記；它是一類由1-6個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，它們廣泛分布于基因組的不同位置。如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十~幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個(gè)位點(diǎn)。二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(四)SSR（簡單重復(fù)序列）標(biāo)記34盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置上，但其兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列。根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)一對特異引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態(tài)性。1、SSR標(biāo)記的原理盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置上，但其兩端的序列35分子標(biāo)記輔助育種ppt課件36微衛(wèi)星分子標(biāo)記對18份山羊草基因型的擴(kuò)增結(jié)果

微衛(wèi)星分子標(biāo)記對18份山羊草基因型的擴(kuò)增結(jié)果372、SSR標(biāo)記的特點(diǎn)（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因組；數(shù)量幾乎無限，（2）SSR技術(shù)一般檢測到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)。（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。2、SSR標(biāo)記的特點(diǎn)（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因組；數(shù)38DNA分子標(biāo)記在植物生物技術(shù)中的應(yīng)用

DNA分子標(biāo)記是現(xiàn)代植物生物技術(shù)中應(yīng)用的重要工具，其應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面：

構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖：在經(jīng)典遺傳學(xué)中由于遺傳標(biāo)記的數(shù)量較少，只能建立稀疏且分布不均勻的遺傳連鎖圖。DNA分子標(biāo)記數(shù)量豐富，為高密度遺傳圖譜的制作提供了可能，促進(jìn)DNA指紋的分析。

DNA分子標(biāo)記在植物生物技術(shù)中的應(yīng)用DNA分子39分子標(biāo)記輔助育種ppt課件40

進(jìn)行基因定位：基因定位就是尋找與目的的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記并確定其在染色體上的位置，高密度遺傳連鎖圖的建立使目的基因的定位更為方便。

進(jìn)行基因定位：基因定位就是尋找與目的的基因緊密連鎖的遺傳41遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系：分子圖譜的構(gòu)建和基因定位更加有利于遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系的研究。植物的遺傳多樣性是品種遺傳改良的基礎(chǔ)。DNA標(biāo)記可以覆蓋整個(gè)基因組，能客觀、準(zhǔn)確地檢測物基因組DNA水平的差異。遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系：分子圖譜的構(gòu)建和基因定位更加有利于42表1

96份參試材料的編號及名稱編號序號材料號編號序號材料號編號序號材料號編號序號材料號1R-1揚(yáng)農(nóng)啤6號25R-25BARI-17649S-1朸系14373S-25BARI-1472R-2揚(yáng)農(nóng)啤7號26R-26BARI-18050S-2連87-34-274S-26BARI-1613R-3蘇農(nóng)91-711227R-27BARI-19251S-3福84-810475S-27BARI-1624R-4廣麥940228R-28BARI-19852S-42004-日引3號76S-28BARI-1665R-5揚(yáng)農(nóng)2號29R-29BARI-19953S-5甘啤2號77S-29BARI-1716R-6鹽93-14630R-30BARI-21254S-6連901578S-30BARI-1737R-7浙934331R-31BARI-23055S-7駐9505-1-379S-31BARI-1748R-8浙708232R-32BARI-23456S-8蘇引麥3號80S-32BARI-1759R-9浙95-5433R-33BARI-24057S-9單281S-33BARI-17810R-1093-16634R-34BARI-24558S-10蘇引麥2號82S-34BARI-18911R-11矮桿-135R-35BARI-26859S-11駐92017-0-2-183S-35BARI-20412R-12蘇農(nóng)647236R-36BARI-27860S-12駐96015-5-284S-36BARI-21313R-13浙農(nóng)大7號37R-37BARI-28061S-132004-日引1號85S-37BARI-23614R-142004-日引4號38R-38BARI-28262S-14新洋01-386S-38Z052K001915R-15揚(yáng)飼麥3號39R-39Z012L031L63S-15鹽95-22187S-39BARI-25816R-16揚(yáng)農(nóng)啤4號40R-40Z010JV45J64S-16鹽96-16688S-40BARI-29117R-17蘇啤3號41R-41Z127O108O65S-17矮桿-489S-41Z001L132L18R-18揚(yáng)輻208542R-42Z127O115O66S-18KA-4B90S-42Z010J016J19R-19揚(yáng)農(nóng)啤8號43R-43Z149O046O67S-19華232891S-43Z125O009020R-20揚(yáng)農(nóng)啤5號44R-44BARI-21068S-20楚大麥3892S-44Z1270087021R-21720445R-45ZB00-014069S-21鄂大麥9號93S-45Z1380024P22R-22揚(yáng)啤1號46R-46Z1170016P70S-223238094S-46Z029P03323R-23泰興94-2547R-47Z1390023P71S-23500395S-47Z058P008P24R-242004-日引2號48R-48Z028P057P72S-24連啤1號96S-48Z067P035P表196份參試材料的編號及名稱編號序號材料號編號序號材43表多態(tài)性的SSR引物表多態(tài)性的SSR引物44

圖

96份大麥材料的SSR標(biāo)記聚類圖

圖96份大麥材料的SSR標(biāo)記聚類圖45圖3當(dāng)K=4時(shí)基于模型的Strcture分析亞群Ⅰ亞群Ⅱ亞群Ⅲ亞群Ⅳ圖3當(dāng)K=4時(shí)基于模型的Strcture分析亞群Ⅰ亞群Ⅱ46

種質(zhì)鑒定和遺傳背景分析：利用DNA分子標(biāo)記可以鑒別品種，評估品種純度，分析農(nóng)藝性狀基因，分離和鑒別遺傳材料，確定染色體同源性，對異源染色體和染色體結(jié)構(gòu)畸變的檢測。種質(zhì)鑒定和遺傳背景分析：利用DNA分子標(biāo)記可以鑒別47分子標(biāo)記輔助育種ppt課件48

育種中的分子標(biāo)記輔助選擇：長期以來，植物育種都是依植株的表型性狀進(jìn)行選擇的。DNA標(biāo)記的出現(xiàn)使植物育種從表型選擇過渡到分子育種的新階段。

育種中的分子標(biāo)記輔助選擇：長期以來，植物育種都是依植株的49第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)目標(biāo)基因的標(biāo)記篩選是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種的基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記與目標(biāo)基因緊密連鎖標(biāo)記實(shí)用性強(qiáng)，重復(fù)性好，而且能夠經(jīng)濟(jì)簡便地檢測大量個(gè)體。不同遺傳背景選擇有效。用于MAS育種的分子標(biāo)記須具備三個(gè)條件：第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)目標(biāo)基因的50一、遺傳圖譜的構(gòu)建與重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)1、構(gòu)建遺傳圖譜的意義：確定不同分子標(biāo)記在染色體上的相對位置或排列情況，為作物種質(zhì)資源收集、目標(biāo)基因定位、基因克隆、育種規(guī)模大小及相應(yīng)育種方法的確定等提供理論依據(jù)。但是，由于分子標(biāo)記數(shù)目的限制，目前作圖親本的選用首先考慮親本間的多態(tài)性水平，育種目標(biāo)性狀考慮較少。一、遺傳圖譜的構(gòu)建與重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記第二節(jié)重要農(nóng)藝性512、遺傳作圖的原理與經(jīng)典連鎖檢測一致，即基于染色體的交換與重組。用重組率來表示基因間的遺傳距離。第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)2、遺傳作圖的原理第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)523、遺傳圖譜構(gòu)建的主要環(huán)節(jié)建立作圖群體群體中不同植株或品系的標(biāo)記基因型的分析

借助計(jì)算機(jī)程序建立標(biāo)記之間的連鎖群

第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)

構(gòu)建遺傳圖譜，首先要選擇合適的親本及分離群體，親本之間的差異不宜過大，否則會降低所建圖譜的準(zhǔn)確度和適用性。而親本間適度的差異范圍因不同物種而異。3、遺傳圖譜構(gòu)建的主要環(huán)節(jié)建立作圖群體群體中不同植株或品系的53第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)4、用于分子標(biāo)記的遺傳作圖群體1）暫時(shí)性分離群體：包括F2群體、BC1等。這類群體中分離單位是個(gè)體，一經(jīng)自交或近交其遺傳組成就會發(fā)生變化，無法永久使用，由于每個(gè)單株所提供的DNA有限，且只能使用一代，限制了該群體的作圖能力；2）永久性分離群體：包括重組自交系群體（RIL）（由F2經(jīng)多代自交一粒傳后使后代基因組相對純合的群體）、加倍單倍體群體（DHL）等。這類群體中分離單位為株系，不同株系之間存在基因型的差異，而株系內(nèi)個(gè)體之間的基因型是相同且純合的，自交后不會發(fā)生分離，因此可通過自交或近交繁殖后代，而不會改變?nèi)后w的遺傳組成，可以永久使用。第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)4、用于分子標(biāo)記的54分子標(biāo)記輔助育種ppt課件55分子標(biāo)記輔助育種ppt課件56分子標(biāo)記輔助育種ppt課件57F2BC1DHRIL群體形成F1自交后代F1回交后代F1花粉分化個(gè)體F2個(gè)體自交后代性狀研究對象個(gè)體個(gè)體品系品系準(zhǔn)確度低低高高必要的群體規(guī)模大大中中分離比例1:2:3或3:11:11:11:1不同作圖群體的特點(diǎn)F2BC1DHRIL群體F1自交后代F1回交后代F1花粉分化58（一）質(zhì)量性狀的分子標(biāo)記二、分子標(biāo)記與基因定位

尋找與質(zhì)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記主要有兩個(gè)目的：在育種中對質(zhì)量性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，對質(zhì)量性狀基因進(jìn)行圖位克隆。主要途徑：近等基因系分析法（NearIsogenicLinesAnalysis，NIL）群體分離分析法（BulkedSegregationAnalysis，BSA）（一）質(zhì)量性狀的分子標(biāo)記二、分子標(biāo)記與基因定位尋找591、NIL（近等基因系）分析法NIL分析法的原理：如果一對近等基因系在目標(biāo)性狀上表現(xiàn)差異，那么凡是能在這對近等基因系之間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記就可能位于目標(biāo)基因的附近。因此利用NIL材料，可以尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。1、NIL（近等基因系）分析法NIL分析法的原理：60基本步驟：1）篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記：利用分子標(biāo)記技術(shù)分析一對近等基因系，篩選在兩者間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物或探針。2）進(jìn)行標(biāo)記與目的基因連鎖的驗(yàn)證：利用多態(tài)性標(biāo)記/探針對近等基因系間雜交分離群體中的單株進(jìn)行篩選，確定每個(gè)單株的標(biāo)記基因型。同步對分離群體中單株的目標(biāo)性狀進(jìn)行調(diào)查。3）基因定位：利用Mapmaker等軟件確定目標(biāo)性狀與標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系，并計(jì)算遺傳距離和繪制連鎖圖。1、NIL分析法基本步驟：1、NIL分析法612、BSA（群體分離）分析法

BSA法是從近等基因系分析法演化而來的，它克服了許多作物沒有或難以創(chuàng)建相應(yīng)的NIL的限制，對于尚無連鎖圖或連鎖圖飽和程度較底的植物，利用BSA法也是快速獲得與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記的有效方法。2、BSA（群體分離）分析法BSA法是從近等基因系分622、BSA分析法BSA分析法的原理在作圖群體中，依據(jù)目標(biāo)性狀表型的相對差異（如抗病與感病、可育與不育等），將個(gè)體或株系分成兩組，分別將兩組中的個(gè)體或株系的DNA等量混合，形成相對的DNA池（DNApool）。這兩個(gè)DNA池之間除了在目標(biāo)基因座所在染色體區(qū)域的DNA組成上存在差異外，來自基因組其它部分的DNA組成應(yīng)該是完全相同或基本相同的，即兩DNA池間差異相當(dāng)于兩近等基因系基因組之間的差異，或者說構(gòu)成了一對近等基因DNA池。因此在這兩個(gè)DNA池之間表現(xiàn)出多態(tài)性的DNA標(biāo)記，就有可能與目標(biāo)基因連鎖。2、BSA分析法BSA分析法的原理在作圖群體中，依據(jù)63基本步驟1）根據(jù)目標(biāo)性狀表型或基因型的相對差異構(gòu)建兩個(gè)近等DNA池或代表群，尋找在兩者之間表現(xiàn)多態(tài)性的標(biāo)記。2）利用分離群體驗(yàn)證候選標(biāo)記是否與目標(biāo)基因緊密連鎖。3）根據(jù)標(biāo)記基因型的分離比例和單株目標(biāo)性狀分離比例進(jìn)行遺傳作圖。2、BSA分析法基本步驟1）根據(jù)目標(biāo)性狀表型或基因型的相對差異構(gòu)建兩個(gè)近等D64（二）數(shù)量性狀的分子標(biāo)記

數(shù)量性狀的遺傳是受多基因控制的，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，易受環(huán)境因素影響，表現(xiàn)為連續(xù)變異，表現(xiàn)型與基因型之間沒有明確的對應(yīng)關(guān)系。因此長期以來對數(shù)量性狀的遺傳研究只能借助于數(shù)理統(tǒng)計(jì)的手段，將控制數(shù)量性狀的多基因系統(tǒng)作為一個(gè)整體來研究，使人們無法了解單個(gè)基因在基因組中的位置和效應(yīng)，制約了人們在育種中對數(shù)量性狀的遺傳操縱能力。而分子標(biāo)記的出現(xiàn)為深入研究數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)提供了可能。（二）數(shù)量性狀的分子標(biāo)記數(shù)量性狀的遺傳是受多基因控制的，遺65（二）數(shù)量性狀的分子標(biāo)記

控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置稱為數(shù)量性狀基因座（QTL）。借助與QTL連鎖的分子標(biāo)記，在育種中人們就能夠?qū)τ嘘P(guān)QTL的遺傳進(jìn)行追蹤，提高對數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的準(zhǔn)確性和預(yù)見性。主要途徑：基于性狀的分析法（trait-basedanalysis，TB）以數(shù)量性狀表型為依據(jù)進(jìn)行分組?；跇?biāo)記的分析法（marker-basedanalysis，MB）以標(biāo)記基因型為依據(jù)進(jìn)行分組（二）數(shù)量性狀的分子標(biāo)記控制數(shù)量性狀的基因在基因組66（三）QTL定位的主要方法

常用的主要有區(qū)間作圖法、復(fù)合區(qū)間作圖法、多元回歸法、已知完整連鎖圖作圖法等，并開發(fā)出一些功能很強(qiáng)的軟件包，如MapManager、Mapmaker/QTL、Linkage、WinQTLCart等。這些程序包都可以從因特網(wǎng)上免費(fèi)下載（/biosci/linkage.html）。利用這些方法，可將控制某一數(shù)量性狀的多個(gè)QTL進(jìn)行分解，像研究質(zhì)量性狀一樣，將它們分別定位于染色體上，并分析各個(gè)QTL的單個(gè)效應(yīng)及互作效應(yīng)。（三）QTL定位的主要方法常用的主要有區(qū)間作圖法、67第三節(jié)作物MAS育種一、作物MAS育種須具備的條件分子標(biāo)記與目標(biāo)基因共分離或緊密連鎖，一般要求兩者間的遺傳距離小于5cM,最好1cM或更小。具有在大群體中利用分子標(biāo)記進(jìn)行篩選的有效手段，主要是應(yīng)用PCR技術(shù)。篩選技術(shù)在不同實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好，且具有經(jīng)濟(jì)、易操作的特點(diǎn)。具有實(shí)用化程度高并能協(xié)助育種家作出抉擇的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件。第三節(jié)作物MAS育種一、作物MAS育種須具備的條件分子標(biāo)68（一）回交育種二、MAS育種方法由單基因或寡基因等質(zhì)量性狀基因控制的主要農(nóng)藝性狀，若利用分子標(biāo)記輔助選擇，針對每一回交世代結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，篩選出含目標(biāo)基因的優(yōu)異品系，進(jìn)一步培育成新品種。（一）回交育種二、MAS育種方法由單基因或寡基因等質(zhì)69受體親本×供體親本(不含優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因)F1×受體親本BC1目標(biāo)基因定位標(biāo)記輔助選擇中選BC1×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因)BC2BC3標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇中選BC3(含優(yōu)質(zhì)基因)新育成的優(yōu)質(zhì)品種(受體親本遺傳本背景+優(yōu)質(zhì)基因)自交目標(biāo)基因的定位與標(biāo)記輔助回交育種相結(jié)合程序圖中選BC1×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因)受體親本×供70（二）大范圍群體內(nèi)的單目標(biāo)基因

（SLS-MAS）分析方法

基本原理在一個(gè)隨機(jī)雜交的混合群體中，首先在一個(gè)很大群體中利用分子標(biāo)記輔助選擇目標(biāo)性狀，盡可能使選擇群體足夠大，使中選的植株就目標(biāo)位點(diǎn)純合，而在目標(biāo)位點(diǎn)以外的其它基因位點(diǎn)上保持有大的遺傳多樣性，最好仍呈孟德爾分離，這樣，分子標(biāo)記篩選后，仍有很大遺傳多樣性供育種家通過傳統(tǒng)育種方法選擇，產(chǎn)生新的品種和雜交種。這種方法對于分子標(biāo)記輔助選擇質(zhì)量性狀或數(shù)量性狀均適用。（二）大范圍群體內(nèi)的單目標(biāo)基因

（SLS-MAS）分析方法711）利用傳統(tǒng)育種方法結(jié)合DNA指紋圖譜選擇用于MAS的優(yōu)異親本，特別對于數(shù)量性狀而言，不同親本針對同一目標(biāo)性狀要具有不同的重要的QTL。即具有更多的等位多樣性。2）確定某重要農(nóng)藝性狀QTL標(biāo)記。利用中選親本與測驗(yàn)系雜交，將F1自交產(chǎn)生分離群體，一般200-300株，結(jié)合F2-3株行田間調(diào)查結(jié)果，以確定主要QTL的分子標(biāo)記。3）結(jié)合篩選的QTL標(biāo)記，對上述分離群體中單株進(jìn)行SLS-MAS。4）根據(jù)標(biāo)記有無選擇目標(biāo)材料。由于連鎖累贅，除中選QTL標(biāo)記外，使其附近其它位點(diǎn)保持最大的遺傳多樣性。通過中選單株自交，根據(jù)本地生態(tài)需要進(jìn)行系統(tǒng)選擇，育成新的優(yōu)異品系?；?qū)⒅羞x單株與測驗(yàn)系雜交產(chǎn)生新雜種?；静襟E1）利用傳統(tǒng)育種方法結(jié)合DNA指紋圖譜選擇用于MAS的優(yōu)異親72（三）MAS聚合育種

在實(shí)際育種工作中，通過聚合雜交將多個(gè)有利目標(biāo)基因聚集到同一品種材料中，培育成一個(gè)具多種有利性狀的品種，如多個(gè)抗性基因的品種，在作物抗病蟲育種中保證品種對病蟲害的持久抗性將有十分重要的作用。（三）MAS聚合育種在實(shí)際育種工作中，通過73但是，由于導(dǎo)入的新基因表現(xiàn)常被預(yù)先存在的基因所掩蓋或者許多基因的表型相似難以區(qū)分、隱性基因需要測交檢測、或接種條件要求很高等，導(dǎo)致許多抗性基因不一定在特定環(huán)境下表現(xiàn)出抗性，造成基于表型的抗性選擇將無法進(jìn)行。但是，由于導(dǎo)入的新基因表現(xiàn)常被預(yù)先存在的基因所掩蓋或者許多基74MAS可利用分子標(biāo)記跟蹤新的有利基因?qū)?，將超過觀測閾值外的有利基因高效地累積起來，為培育含有多抗、優(yōu)質(zhì)基因的品種提供了重要的途徑。MAS可利用分子標(biāo)記跟蹤新的有利基因?qū)?，將超過觀測閾值外的75受體親本×供體親本A(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因A)受體親本×供體親本B(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因B)F1(含優(yōu)質(zhì)基因A)×F1(含優(yōu)質(zhì)基因B)復(fù)雜雜種(分離群體)受體親本×供體親本C(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因C)中選雜種個(gè)體×F1(含優(yōu)質(zhì)基因A和B)(含優(yōu)質(zhì)基因C)復(fù)雜雜種(分離群體)中選雜種個(gè)體×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因A、B和C)新育成的優(yōu)質(zhì)品種(受體親本遺傳背景+優(yōu)質(zhì)基因A、B和C)回交1~2代，標(biāo)記輔助選擇自交標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助基因聚合與品質(zhì)改良相結(jié)合程序圖受體親本×供體親本A受體76分子標(biāo)記輔助育種ppt課件77分子標(biāo)記輔助育種ppt課件78進(jìn)行MAS選擇的限制因素

作物基因作圖速度還相當(dāng)緩慢，一些重要性狀的分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀間的遺傳距離仍較大，不符合MAS的要求。已篩選出的分子標(biāo)記在不同遺傳背景中表現(xiàn)不穩(wěn)定，甚至同樣的目標(biāo)基因同樣的標(biāo)記在不同群體中其重組率會有差異。特別是呈數(shù)量性狀遺傳的性狀的分子標(biāo)記更易受遺傳背景影響。基于PCR技術(shù)的標(biāo)記數(shù)量有限。特別是已篩選到一些與重要農(nóng)藝性狀基因的分子標(biāo)記大都不是PCR標(biāo)記，因此不易應(yīng)用于MAS中。利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行MAS的成本較高，不能滿足大規(guī)模育種選擇的需要。生物技術(shù)手段與常規(guī)育種嚴(yán)重脫節(jié)。作物育種學(xué)家與分子遺傳學(xué)家之間的有機(jī)結(jié)合、溝通不夠。進(jìn)行MAS選擇的限制因素作物基因作圖速度還相當(dāng)緩慢，一些重79三、提高分子標(biāo)記的篩選