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文檔簡介
目的要求(1)學(xué)習(xí)采用離子交換樹脂分離氨基酸的基本原理。(2)掌握離子交換柱層析法的基本操作技術(shù)。目的要求1一、原理
離子交換層析是用離子交換劑(具有離子交換性能的物質(zhì))作固定相,利用它與流動相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的層析方法。?
即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反應(yīng)的過程。一、原理
離子交換層析是用離子交換劑(具有離子交換性能的物質(zhì)2實(shí)驗(yàn)五-離子交換柱層析法分離氨基酸課件3實(shí)驗(yàn)五-離子交換柱層析法分離氨基酸課件4
帶電荷量少,親和力小的先被洗脫下來,帶電荷量多,親和力大的后被洗脫下來。帶電荷量少,親和力小的先被洗脫下來,帶電5離子交換過程示意:起始吸附解吸完成
x+:起始緩沖離子
y+:待分離離子
z+:待分離離子
離子交換過程示意:6二、離子交換劑的種類
在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離子交換劑。(一)按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑—帶負(fù)電荷,與陽離子交換陰離子交換劑
—帶正電荷,與陰離子交換二、離子交換劑的種類
在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即7(二)按載體種類不同1.離子交換樹脂:主要有聚苯乙烯樹脂苯乙烯+二乙烯苯
聚苯乙烯(單體)(交聯(lián)劑)二乙烯苯交聯(lián)度
=————————×100%
苯乙烯+二乙烯苯(二)按載體種類不同8交聯(lián)度大,網(wǎng)孔變小,大分子量的離子不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。在不影響分離的情況下,以采用交聯(lián)度較高的樹脂為好,這樣可以提高樹脂對離子的選擇性。交聯(lián)度大,網(wǎng)孔變小,大分子量的離子不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子9目數(shù):離子交換樹脂的顆粒直徑大小Dowex50為20-50目Dowex20840m50297m100149m
(代表二乙烯苯的百分含量)目數(shù):離子交換樹脂的顆粒直徑大小10樹脂resin(據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分)陽離子交換樹脂
強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(R-SO3H)
中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4)
弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹脂
強(qiáng)堿含季胺基團(tuán)[-N+(CH3)3]
弱堿含叔胺、伯胺基團(tuán)[-N(CH3)2
陰離子交換樹脂對化學(xué)試劑及熱都不如陽離子交換樹脂穩(wěn)定。
樹脂resin(據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分)112.離子交換纖維素陰離子交換纖維素—如:DEAE-纖維素pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙基陽離子交換纖維素—如:CM-纖維素一般pH>4條件下使用,具有羧甲基2.離子交換纖維素123.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)如:葡聚糖(Sephadex)、聚丙烯酰胺(PAG)、瓊脂糖(Sepharose)3.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)13三、操作注意點(diǎn)
(一)離子交換劑的選擇原則:根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇—同一性質(zhì)離子交換劑中選用對被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的型號交換劑,以保證通過離子交換層析后能得到比較滿意的結(jié)果。三、操作注意點(diǎn)
(一)離子交換劑的選擇14考慮因素:1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠,其次選用纖維素3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量考慮因素:15根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件強(qiáng)酸強(qiáng)堿—應(yīng)用廣泛弱酸型—只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型—只能在酸性pH范圍內(nèi)使用根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件16(二)緩沖液的選擇原則:不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng),所帶電荷應(yīng)與樣品一致。避免使樣品變性(二)緩沖液的選擇17(三)洗脫劑
原則:所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離子或基團(tuán)改變pH或離子強(qiáng)度增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力洗脫方式:梯度洗脫(三)洗脫劑18四、應(yīng)用
分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子四、應(yīng)用
分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子19離子交換層析法分離氨基酸及測定
離子交換層析法分離氨基酸及測定20[原理]
所用樣品為天冬氨酸和賴氨酸的混合液,分別屬酸性氨基酸(pI2.77)、堿性氨基酸(pI9.74),在緩沖溶液中分別帶正電荷和負(fù)電荷,與強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂Dowex50親和力有很大不同,在一定的洗脫條件下洗脫,將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定。[原理]所用樣品為天冬氨酸和賴氨酸的混合液,分21紫色物質(zhì),用于α-氨基酸的比色測定和紙層析顯色與水含茚三酮的反應(yīng):紫色物質(zhì),用于α-氨基酸的比色測定和紙層析顯色與水含茚三酮的22
AspLyspH4.2pH>10Asp23[器材]
1.
層析柱等2.
沸水浴[器材]1.
層析柱等24[試劑]
Dowex502mol/LNaOHpH5.3檸檬酸緩沖液樣品液:氨基酸混合液茚三酮混合液[試劑]Dowex5025實(shí)驗(yàn)步驟1.樹脂的處理將干的強(qiáng)酸型樹脂用蒸餾水浸泡過夜,使之充分溶脹。用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡1小時(shí),傾去清液,洗至中性。再用2mol/L的氫氧化鈉處理,做法同上。最后用欲使用的緩沖液浸泡。2.裝柱取直徑1cm,長度10-12cm的層析柱。將柱垂直至于鐵架上。自頂部注入上述經(jīng)處理的樹脂懸浮液,關(guān)閉層析柱出口,待樹脂沉降后,放出過量溶液,再加入一些樹脂,至樹脂沉降至8~10cm的高度即可。裝柱要求連續(xù)、均勻,無紋格、無氣泡,表面平整。液面不低于樹脂。實(shí)驗(yàn)步驟26
3.平衡將緩沖液瓶與恒流泵相連,恒流泵出口與層析柱入口相連,樹脂表面保留3-4cm液層,開動衡流泵,以24ml/h流速平衡,直至流出液pH與洗脫液相同。
4.加樣揭去層析柱上口蓋子,待柱內(nèi)液面至樹脂表面1-2mm關(guān)閉出口,沿管壁四周小心加入0.5ml樣品,慢慢打開出口,同時(shí)開始收集流出液。當(dāng)樣品液彎月面靠近樹脂頂端時(shí),即刻加入少量檸檬酸緩沖液沖洗加樣品處數(shù)次,然后注入檸檬酸緩沖液至液面高3-4cm左右,接恒流泵。
5.洗脫以緩沖液洗脫,開始用試管收集洗脫液,每管收集1mL,共收集60—80管。3.平衡27
6.洗脫及氨基酸的鑒定
向各管收集液中加1mL水合茚三酮顯色劑并混勻,在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min后冷卻至室溫,再加入3mL的0.1%硫酸銅溶液?;靹?,以收集液第2管為空白,測定A570波長的光吸收值,以光吸收值為縱坐標(biāo),以洗脫液體積為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。6.洗脫及氨基酸的鑒定28實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)氨基酸的解離性質(zhì),分析該實(shí)驗(yàn)條件下氨基酸從層析柱洗脫下來的順序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果29Separationofaminoacidsonacati
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