菌種保藏技術-菌種遺傳與變異

基因重組的概念：來自兩個不同細胞的基因（DNA）所發(fā)生的轉移和結合稱為基因重組?；虻霓D移和重組大大增加了生物的遺傳多樣性。在微生物中，基因的傳遞可以使病毒將遺傳信息傳給細菌，使細菌致病性得以提高以及細菌產生抗生素抗性等。另一方面人為的控制微生物的基因轉移和重組的研究成果有助于解決農業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學問題以及預防和治療傳染病的難題。本項目將介紹微生物基因轉移和重組的四種現(xiàn)象和機制。轉化受體菌直接吸收來自供體菌的DNA片段，通過交換將其整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為轉化。通過轉化方式而形成的雜種后代，稱為轉化子。轉化因子指有轉化活性的外源DNA片段，它是供體菌釋放或人工提取的游離DNA片段。圖6.5轉化過程示意圖

接合

接合是通過供體菌和受體菌的直接接觸而產生的遺傳信息的轉移和重組過程。

細菌的接合現(xiàn)象在大腸桿菌中研究的最清楚。大腸桿菌有性別分化，決定它們性別的因子稱為F因子。F因子是一種質粒，在大腸桿菌中每個細胞含有約1～4個F因子。F因子既可脫離染色體在細胞內獨立存在，也可整合到染色體組上；它既可經過接合作用而獲得，也可通過一些理化因素(如吖啶橙、絲裂霉素、利福平、溴化乙錠和加熱等)的處理而從細胞中消除。含有F因子的大腸桿菌稱為F＋菌株，不含有F因子的大腸桿菌稱為F－菌株。

F＋菌株可以與不含F(xiàn)因子的F－菌株接合，從而使后者也成為F＋菌株。其過程大體可分兩個階段：首先是F＋菌株與F－菌株配對，并通過性菌毛接合；然后F因子雙鏈DNA的一條單鏈在一特定的位置斷開，通過性菌毛內腔向F－菌株細胞內轉移，并同時在兩個菌株細胞內以一條DNA單鏈為模板，各自復制合成完整的F因子。F＋和F－接合示意圖轉導通過缺陷噬菌體的媒介，把供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉導。由轉導作用而獲得部分新遺傳性狀的重組細胞，稱為轉導子。轉導現(xiàn)象是由J.Lederberg等(1952年)首先在鼠傷寒沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)的。以后在許多原核微生物中都陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了轉導，如大腸桿菌屬，芽孢桿菌屬，變形桿菌屬，假單胞菌屬，志賀氏菌屬和葡萄球菌屬等。轉導現(xiàn)象在自然界中比較普通，它在低等生物進化過程中很可能是一種產生新基因組合的重要方式。一、普遍轉導

通過極少數完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉導。噬菌體侵入寄主細胞后，通過復制和合成，亦將寄主DNA降解為許多小片段，進入裝配階段。正常情況下，噬菌體將自身的DNA包裹在衣殼中，但也有異常的可能。它誤將寄主細胞DNA的某一片段包裹進去。這樣的噬菌體稱缺陷噬菌體。體內僅含有供體DNA的缺陷噬菌體稱完全缺陷噬菌體。體內同時含有供體DNA和噬菌體DNA的缺陷噬菌體稱為部分缺陷噬菌體。這種異常情況出現(xiàn)的概率很低（10-5～10-8)。由于噬菌體產生子代數量很多，所以這種異常情況的出現(xiàn)還是很多的。當包裹有寄主DNA片段的噬菌體釋放后，再度感染新的寄主，其中的供體菌的DNA片段進入受體菌，并通過基因重組使受體菌形成穩(wěn)定的轉導子。二、局限轉導

局限性轉導指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉導子的現(xiàn)象。最初于1954年在大腸桿菌K12中發(fā)現(xiàn)。它只能轉導一種或少數幾種基因（一般為位于附著點兩側的基因）。原生質體融合

通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程，稱為原生質體融合。由此法獲得的重組子，稱為融合子。原核生物原生質體融合研究是從20世紀70年代后期才發(fā)展起來的一種較有效的遺傳物質轉移手段。

原生質體融合的主要操作步驟是：先選擇兩株有特殊價值，并帶有選擇性遺傳標記的細胞作為親本菌株置于等滲溶液中，用適當的脫壁酶（如細菌和放線菌可用溶菌酶等處理，真菌可用蝸牛消化酶或其他相應酶處理）去除細胞壁，再將形成的原生質體（包括球狀體）進行離心聚集，加入促融合劑PEG(聚乙二醇)或借電脈沖等因素促進融合，然后用等滲溶液稀釋，再涂在能促使它再生細胞壁和進行細胞分裂的基本培養(yǎng)基平板上。待形成菌落后，再通過影印平板法，把它接種到各種選擇性培養(yǎng)基平板上，檢驗它們是否為穩(wěn)定的融合子，最后再測定其有關生物學性狀或生產性能。參見圖6.8、6.9。圖6.9原生質體融合顯微觀察謝謝基因突變的概念基因突變是指遺傳物質的分子結構或數量發(fā)生的可遺傳的變化。俠義的突變專指點突變，所謂點突變是指一個基因內部遺傳結構或DNA序列的任何改變，包括一對或少數幾對堿基的缺失、插入或置換，而導致的遺傳變化。廣義的突變包括點突變和染色體畸變，染色體畸變是指大段染色體的缺失、重復、倒位、易位。在微生物中，點突變是最常見、最易發(fā)生的一種突變現(xiàn)象。從自然界分離到的菌株一般稱野生型菌株，或稱野生型。野生型經突變后形成的帶有新性狀的菌株，稱突變株?；蛲蛔兊念愋?.營養(yǎng)缺陷型某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法在基本培養(yǎng)基（MM）上正常生長繁殖的變異類型，稱為營養(yǎng)缺陷型。它們可在加有相應營養(yǎng)物質的基本培養(yǎng)基平板上選出。它的基因型常用所需營養(yǎng)物的前三個英文小寫斜體字母表示，例如hisC、tryA分表代表組氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型，其中的大寫字母C和A表示同一表型中不同基因的突變。相應的表型則用HisC和TrgA表示。常用hisC-和hisC+分別表示缺陷型和野生型。營養(yǎng)缺陷型突變株在遺傳學、分子生物學、遺傳工程和育種等工作中十分有用。2.抗性突變型抗性突變型是指野生型菌株因發(fā)生基因突變，而產生的對某化學藥物或致死物理因子的抗性變異類型，它們可在加有相應藥物或用相應物理因子處理的培養(yǎng)基平板上選出?？剐酝蛔冃推毡榇嬖冢鐚σ恍┛股鼐呖顾幮缘木甑?。這類突變類型常用所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”表示，如：strr和strs分別表示對鏈霉素的抗性和敏感性。在加有相應抗生素的平板上，只有抗性突變能生長，所以抗性突變型菌株在遺傳學、分子生物學、遺傳育種和遺傳工程等研究中極其重要。

基因突變類型3.條件致死突變型某菌株或病毒經基因突變后，在原本可以生長、繁殖的條件下卻無法生長、繁殖，這種突變類型稱為條件致死突變型。其中最常用的是溫度敏感條件致死突變株，用ts（temperature-sensitive)表示，這類突變株在特定溫度（28～35℃）下能夠增殖，在非特定溫度（37～40℃）下則不能生長、繁殖，而野生型在兩種溫度均能增殖。顯然是由于在非特定溫度下，突變基因所編碼的蛋白缺乏其應有功能。選育病毒ts株是制備疫苗的重要方法，現(xiàn)已從許多動物病毒中分離出ts株，選擇遺傳穩(wěn)定性良好的品系用于制備減毒活疫苗，如流感病毒及脊髓灰質炎病毒ts株疫苗。另外還通過條件致死突變株來研究那些生長繁殖所必須的基因。4.形態(tài)突變型形態(tài)突變型是指由突變引起的個體或菌落形態(tài)的變異。例如，細菌的鞭毛或莢膜的有無，霉菌或放線菌的孢子有無或顏色變化，菌落表面的光滑、粗糙以及噬菌斑的大小、清晰度等的突變。5.抗原突變型抗原突變型是指由于基因突變引起的細胞抗原結構發(fā)生的變異類型，包括細胞壁缺陷變異（L型細菌等）、莢膜或鞭毛成分變異等。6.其它突變型如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產物的種類和產量以及對某種藥物的依賴性等的突變型?；蛲蛔兊臋C制:基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的。一、自發(fā)突變

自發(fā)突變是指生物體在無人工干預下自然發(fā)生的低頻率突變。隨誘變機制的研究，對自發(fā)突變的原因已有所認識，下面討論幾種自發(fā)突變的可能機制。1、背景輻射和環(huán)境因素的誘變

不少“自發(fā)突變”實質上是由一些原因不詳的低劑量誘變因素長期的綜合效應導致。例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、高溫的誘變效應以及自然界中普遍存在的一些低濃度的誘變物質的作用等。2、微生物自身有害代謝產物的誘變

過氧化氫是普遍存在于微生物體內的一種代謝產物，它對脈孢菌具有誘變作用。這種作用可因同時加入過氧化氫酶而降低，如果同時再加入過氧化氫酶抑制劑，則又可提高突變率。這就說明，過氧化氫可能是自發(fā)突變中的一種內源誘變劑。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因。

3、由DNA復制過程中堿基配對錯誤引起

據統(tǒng)計，DNA鏈每次復制中，每個堿基對錯誤配對的頻率是10-7～10-11，而一個基因平均約含1000bp，故自發(fā)突變頻率約為10-6。因此，若對細菌做一般液體培養(yǎng)時，因其細胞濃度?？蛇_到108個/ml，故經常會在其中產生自發(fā)突變株?；蛲蛔兊囊?guī)律1、不對應性

即突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應關系。例如，細菌在有青霉素的環(huán)境下，出現(xiàn)了抗青霉素的突變體；在紫外線的作用下，出現(xiàn)了抗紫外線的突變體；在較高的培養(yǎng)溫度下，出現(xiàn)了耐高溫的突變體等。從表面上看，會認為正是由于青霉素、紫外線或高溫的“誘變”，才產生了相對應的突變性狀。事實恰恰相反，這類性狀都可通過自發(fā)的或其他任何誘變因子誘發(fā)得到。這里的青霉素、紫外線或高溫僅是起著淘汰原有非突變型(敏感型)個體的作用。

2、自發(fā)性

由于自然界環(huán)境因素的影響和微生物內在的生理生化特點，在沒有人為誘發(fā)因素的情況下，各種遺傳性狀的改變可以自發(fā)地產生。3、稀有性

指自發(fā)突變的頻率較低，而且穩(wěn)定，一般在10-6～10-9

間。4、獨立性

突變的發(fā)生一般是獨立的，即在某一群體中，既可發(fā)生抗青霉素的突變型，也可發(fā)生抗鏈霉素或任何其他藥物的抗藥性。某一基因的突變，即不提高也不降低其他任何基因的突變率。突變不僅對某一細胞是隨機的，且對某一基因也是隨機的。5、可誘變性

通過各種物理、化學誘變劑的作用，可提高突變率，一般可提高10～105倍。6、穩(wěn)定性

由于突變的根源是遺傳物質結構上發(fā)生了穩(wěn)定的變化，所以產生的新性狀也是穩(wěn)定的和可遺傳的。7、可逆性

由原始的野生型基因變異為突變型基因的過程稱為正向突變，相反的過程則稱為回復突變。實驗證明，任何性狀既有可能正向突變，也有可能發(fā)生回復突變，兩者發(fā)生的頻率基本相同。謝謝一、菌種的衰退（一）菌種衰退的現(xiàn)象

菌種衰退（degeneration）是指由于自發(fā)突變的結果，而使某物種原有的一系列生物學性狀發(fā)生量變或質變的現(xiàn)象。菌種衰退的具體表現(xiàn)有以下幾個方面。

1.菌落和細胞形態(tài)改變每一種微生物在一定的培養(yǎng)條件下都有一定的形態(tài)特征，如果典型的形態(tài)特征逐漸減少，就表現(xiàn)為衰退。例如，涇陽鏈霉菌“5406”的菌落原來為凸形變成了扇形、帽形或小山形；孢子絲由原來螺旋形變成波曲形或直形，孢子從橢圓形變成圓柱形等。2.生長速度緩慢，產孢子越來越少

例如，“5406”的菌苔變薄，生長緩慢（半個月以上才長出菌落），不產生豐富的橘紅色的孢子層，有時甚至只長些黃綠色的基內菌絲。

3.代謝產物生產能力的下降，即出現(xiàn)負突變

例如，黑曲霉糖化力、放線菌抗生素發(fā)酵單位的下降以及各種發(fā)酵代謝產物量的減少等，在生產上是十分不利的。

4.致病菌對宿主侵染能力下降

例如白僵菌對宿主致病能力的降低等。

5.對外界不良條件（包括低溫、高溫或噬菌體侵染等）抵抗能力的下降等

例如抗噬菌體菌株變?yōu)槊舾芯甑?。（二）菌種衰退的原因

菌種衰退不是突然發(fā)生的，而是從量變到質變的逐步演變過程。開始時，在群體細胞中僅有個別細胞發(fā)生自發(fā)突變（一般均為負變），不會使群體菌株性能發(fā)生改變。經過連續(xù)傳代，群體中的負變個體達到一定數量，發(fā)展成為優(yōu)勢群體，從而使整個群體表現(xiàn)為嚴重的衰退。經分析發(fā)現(xiàn)，導致這一現(xiàn)象的原因有以下幾方面。

1.基因突變菌種衰退的主要原因是有關基因的負突變。如果控制產量的基因發(fā)生負突變，則表現(xiàn)為產量下降；如果控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則產生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發(fā)生自發(fā)突變。雖然自發(fā)突變的頻率很低（一般為10-6～10-9），尤其是對于某一特定基因來說，突變頻率更低。但是由于微生物具有極高的代謝繁殖能力，隨著傳代次數增加，衰退細胞的數目就會不斷增加，在數量上逐漸占優(yōu)勢，最終成為一株衰退了的菌株。表型延遲現(xiàn)象也會造成菌種衰退。例如在誘變育種過程中，經常會發(fā)現(xiàn)某菌株初篩時產量較高，進行復篩時產量卻下降了。質粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產中較多，不少抗生素的合成是受質粒控制的。當菌株細胞由于自發(fā)突變或外界條件影響（如高溫），致使控制產量的質粒脫落或者核內DNA和質粒復制不一致，即DNA復制速度超過質粒，經多次傳代后，某些細胞中就不具有對產量起決定作用的質粒，這類細胞數量不斷提高達到優(yōu)勢，則菌種表現(xiàn)為衰退。2.連續(xù)傳代連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。一方面，傳代次數越多，發(fā)生自發(fā)突變（尤其是負突變）的概率越高；另一方面，傳代次數越多，群體中個別的衰退型細胞數量增加并占據優(yōu)勢越快，致使群體表型出現(xiàn)衰退。3.不適宜的培養(yǎng)和保藏條件不適宜的培養(yǎng)和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。不良的培養(yǎng)條件如營養(yǎng)成分、溫度、濕度、pH、通氣量等和保藏條件如營養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等，不僅會誘發(fā)衰退型細胞的出現(xiàn)，還會促進衰退細胞迅速繁殖，在數量上大大超過正常細胞，造成菌種衰退。（三）菌種衰退的防止根據菌種衰退原因的分析,可以制定出一些防治衰退的措施，主要從以下幾方面考慮。1.控制傳代次數意即盡量避免不必要的移種和傳代，將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的發(fā)生率。一套良好的菌種保藏方法可大大減少不必要的移種和傳代次數。2.創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個適合原種的良好培養(yǎng)條件，可以防止菌種衰退。如培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型菌株時應保證適當的營養(yǎng)成分，尤其是生長因子；培養(yǎng)一些抗性菌時應添加一定濃度的藥物于培養(yǎng)基中,使回復的敏感型菌株的生長受到抑制，而生產菌能正常生長；控制好碳源、氮源等培養(yǎng)基成分和pH、溫度等培養(yǎng)條件，使之有利于正常菌株生長，限制退化菌株的數量，防止衰退。例如，利用菟絲子的種子汁培養(yǎng)“魯保一號”真菌可防止其退化；在赤霉素生產菌藤倉赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天冬酰胺，谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等豐富營養(yǎng)物時，也有防止菌種衰退的效果；此外，將培養(yǎng)棲土曲霉（Aspergillusterricola）3.942的溫度從28℃～30℃提高到33℃～34℃，可防止其產孢子能力的衰退。3.利用不易衰退的細胞移種傳代在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細胞常含幾個細胞核，甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就不會發(fā)生這種現(xiàn)象。在實踐中，若用滅過菌的棉團輕巧地對放線菌進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止衰退的效果；另外，有些霉菌（如構巢曲霉）若用其分生孢子傳代就易衰退，而改用子囊孢子移種則能避免衰退。（三）菌種衰退的防止4.采用有效的菌種保藏方法有效的菌種保藏方法是防止菌種衰退的極其必要的措施。在實踐中，應當有針對性的選擇菌種保藏的方法。例如，啤酒釀造中常用的釀酒酵母，保持其優(yōu)良發(fā)酵性能最有效的保藏方法是-70℃低溫保藏，其次是4℃低溫保藏，若采用對于絕大多數微生物保藏效果很好的冷凍干燥保藏法和液氮保藏法，其效果并不理想。一般斜面冰箱保藏法只適用于短期保藏，而需要長期保藏的菌種，應當采用砂土管保藏法、冷凍干燥保藏法及液氮保藏法等方法。對于比較重要的菌種，盡可能采用多種保藏方法。工業(yè)生產用菌種的主要性狀都屬于數量性狀，而這類性狀恰是最易衰退的。即使在較好的保藏條件下，還是存在這種情況。例如鏈霉素產生菌——灰色鏈霉菌的菌種保藏即使是用冷凍干燥保藏法等現(xiàn)今較好的方法，還是會出現(xiàn)這類情況。由此說明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種的衰退。5.講究菌種選育技術在菌種選育時，應盡量使用單核細胞或孢子，并采用較高劑量使單鏈突變而使另一單鏈喪失作為模板的能力，避免表型延遲現(xiàn)象。同時，在誘變處理后應進行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證菌種的純度。6.定期進行分離純化定期進行分離純化，對相應指標進行檢查，也是有效防止菌種衰退的方法。此方法將在菌種復壯部分介紹。二、菌種的復壯（一）復壯概念

從菌種衰退的本質可以看出，通常在已衰退的菌種中存在有一定數量尚未衰退的個體。狹義的復