黃秦保肝作用機(jī)制的初步研究

黃秦保肝作用機(jī)制的初步研究

黃秦是龍膽科秦屬植物。非酒精性肝病(non-acoholicliverdisease,NALD)是指除酒精和其他明確的損肝因素外引起的人體內(nèi)肝臟損傷、脂類代謝混亂等異常的病癥,其病理學(xué)改變與酒精性脂肪肝類似,均以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積為主要特征網(wǎng)絡(luò)藥理是融合多向藥理學(xué)和生物信息學(xué)的系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫,可將藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合,適用于解釋“多成分-多途徑-多靶點(diǎn)”民族藥的作用關(guān)系數(shù)據(jù)和方法黃秦玉集化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫由中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所承擔(dān)建設(shè),服務(wù)于化學(xué)化工研究和開發(fā)的綜合性信息系統(tǒng)。檢索詞為“黃秦艽”,物種名稱—活性成分的篩選類藥性分析是分析化合物成為藥物的可能性,Linpinski五規(guī)則是類藥性分析的經(jīng)典方法,也是對口服藥物類藥性經(jīng)驗(yàn)型規(guī)律總結(jié)。具體內(nèi)容包括相對分子質(zhì)量小于500;氫鍵給體數(shù)目小于5;氫鍵受體數(shù)目小于10;脂水分配系數(shù)小于5。符合Linpinski規(guī)則的化合物會有更好的藥代動力學(xué)性質(zhì),在生物體內(nèi)代謝過程中會有更高的生物利用度化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測藥材化學(xué)成分通過與人體特定靶點(diǎn)相結(jié)合,通過調(diào)節(jié)靶點(diǎn)生物活性或轉(zhuǎn)錄水平,使藥物發(fā)揮治療疾病的作用。依據(jù)分子相似性原理,應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,預(yù)測化學(xué)成分的作用靶點(diǎn),是化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測的有效方法。SwissTargetPrediction是一款小分子作用靶點(diǎn)預(yù)測的在線分析軟件,能夠基于分子相似性原理預(yù)測小分子化合物的作用靶點(diǎn)非酒精性肝疾病的基因組和篩選OMIM(/)、GEO(/geo/)、HPO(http://human-phnotype-ontology.gtihub.io/)數(shù)據(jù)庫可以通過輸入關(guān)鍵詞查找分析和關(guān)鍵詞相關(guān)的人類基因。將非酒精性肝損傷(non-alcoholicliverinjury)、非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease)、肝氧化應(yīng)激(hepaticoxidativestress)等非酒精性肝病作為關(guān)鍵詞輸入,物種設(shè)置為allhumangenes,進(jìn)行運(yùn)行分析后,篩掉重復(fù)值,并搜索文獻(xiàn)驗(yàn)證。最后獲得非酒精性肝病的潛在作用靶點(diǎn)。cytscape3.2活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建黃秦艽保肝作用的類藥性成分為黃秦艽保肝作用的活性成分。本研究基于黃秦艽保肝作用靶點(diǎn)-活性成分網(wǎng)絡(luò)分析黃秦艽保肝作用的活性成分。依據(jù)活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的中心性參數(shù)分析黃秦艽保肝作用的主要活性成分。Cytoscape是一款圖形化軟件,可以依據(jù)節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行編輯和分析。本研究用“節(jié)點(diǎn)”(node)表示活性成分、作用靶點(diǎn),用“邊”(edge)表示活性成分與靶點(diǎn)之間關(guān)系,依據(jù)黃秦艽活性成分與作用靶點(diǎn)的對應(yīng)關(guān)系,應(yīng)用Cytoscape3.2.1構(gòu)建黃秦艽活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。中心性(centrality)是生物網(wǎng)絡(luò)中任意節(jié)點(diǎn)在整個網(wǎng)絡(luò)中所在中心的程度,度(degree)是在網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心性指標(biāo)。節(jié)點(diǎn)度值越大這個節(jié)點(diǎn)的中心性越高。本研究以活性成分在網(wǎng)絡(luò)中的度值分析黃秦艽保肝作用的主要活性成分。生物功能標(biāo)注生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID,/,Version6.8)為大規(guī)模的基因或蛋白富集工具,提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息,能夠找出最顯著富集的生物學(xué)注釋。將黃秦艽保肝作用的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫,Selectidentifier設(shè)置為officialgenesymbol,Listtype設(shè)置為genelist,限定物種為homosapiens,閾值tsv文件的生成通過將黃秦艽活性成分作用靶點(diǎn)和非酒精性肝疾病作用靶點(diǎn)分別在STRING數(shù)據(jù)庫(/)制作相應(yīng)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,即成分-靶點(diǎn)PPI和疾病-靶點(diǎn)PPI,導(dǎo)出TSV文件。利用Cytoscape3.2.1軟件將活性成分靶點(diǎn)和非酒精性肝病靶點(diǎn)進(jìn)行“merge”后取交集部分,建立可視網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D,并導(dǎo)出拓?fù)鋽?shù)據(jù)。中心性(centrality)是生物網(wǎng)絡(luò)中任意節(jié)點(diǎn)在整個網(wǎng)絡(luò)中所在中心的程度。節(jié)點(diǎn)度值越大這個節(jié)點(diǎn)的中心性越高。最后,以degree中位數(shù)“12.13384914”和最大值“537.3178711”為篩選范圍進(jìn)行篩選肝外實(shí)驗(yàn)的證實(shí)橋博士鑒定黃秦艽根藥材,購于云南大理市藥材市場周盛藥材行(憑證S20140710)。藥材經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院劉新橋博士鑒定。將黃秦艽根藥材經(jīng)粉碎后過40號篩,稱取4200g粗粉末置于玻璃容器中,加8倍量的蒸餾水浸泡過夜,于95℃加熱煎煮提取,提取過程重復(fù)3次,每次3h,4000r·min丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT),天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號均為20180830)。細(xì)胞培養(yǎng)LO2細(xì)胞由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供。將LO2肝細(xì)胞復(fù)蘇后在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于37℃,5%COr-pcr法檢測相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)采用RT-PCR方法,以GAPDH作為參照基因,檢測TNF-統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS22.0軟件分析處理,并以結(jié)果單體成分預(yù)測通過TCMSP篩選并結(jié)合文獻(xiàn)和前期本實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)分析得到黃秦艽14種主要成分,以M1～M14命名,分別預(yù)測所有單體成分,共得到靶點(diǎn)287個,見表2。利用Cytoscape3.2.1軟件,將黃秦艽14種有效成分和287個有效靶點(diǎn)建立可視網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D,見圖1。黃秦保肝作用靶點(diǎn)依據(jù)黃秦艽保護(hù)肝損傷作用靶點(diǎn)-成分關(guān)系,應(yīng)用Cytoscape軟件將靶點(diǎn)-成分對應(yīng)關(guān)系可視化為黃秦艽保護(hù)肝損傷的作用靶點(diǎn)-活性成分網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共包括27個節(jié)點(diǎn),30條邊。其中13個節(jié)點(diǎn)為黃秦艽保肝作用靶點(diǎn),14個節(jié)點(diǎn)為與黃秦艽保肝作用靶點(diǎn)有直接作用關(guān)系的活性成分。該網(wǎng)絡(luò)說明黃秦艽保護(hù)肝損傷作用有可能是多成分、多靶點(diǎn)作用的結(jié)果。在黃秦艽保肝作用網(wǎng)絡(luò)中,度排列前3的成分為1,7-dihydroxy-3-methoxyxanthone、dibutylfumarate、1-hydroxy-2,3,7-trimethoxyxanthone。這些成分是黃秦艽保肝的關(guān)鍵活性成分。黃秦艽發(fā)揮保肝作用的核心靶點(diǎn)見圖2。傷相關(guān)基因及黃秦作用靶點(diǎn)的篩選基于OMIM數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫共篩選出有關(guān)“非酒精性肝損傷”的基因靶點(diǎn)587個。對非酒精性肝損傷相關(guān)基因及黃秦艽作用靶點(diǎn)基因組進(jìn)行“merge”分析,以中位數(shù)進(jìn)行篩選得到TGM2,ADORA2A,IL2,MAPK8,MET,FGFR1,TNF,KDR,FLT1,MTOR,MAPK14,STAT3,EGFR共13個核心靶點(diǎn),見表3。這些基因有可能是黃秦艽治療非酒精性肝病的作用靶點(diǎn)。靶點(diǎn)屬性提取將黃秦艽預(yù)防肝損傷作用的13個靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫(/web/DisGeNET/menu),提取靶點(diǎn)對應(yīng)的類型見表4。黃秦艽保肝作用的靶點(diǎn)主要蛋白類型為傳導(dǎo)因表3子、受體和信號分子等?；蛏锕δ蹽O生物功能分析是從生物功能上對基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化注釋。通過GO富集分析可以獲得基因的生物學(xué)功能。DAVID是大規(guī)模基因生物過程及通路富集在線分析工具,通過將目標(biāo)基因?qū)隓AVID可以方便地分析和獲取基因?qū)?yīng)的生物過程、生物功能和通路等信息KEGG通路富集分析,提取網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度參數(shù)本研究基于STRING數(shù)據(jù)庫分析黃秦艽保肝作用靶點(diǎn)之間的交互作用,以交互作用可信度大于中位數(shù)以上的靶點(diǎn)構(gòu)建黃秦艽保肝作用的核心靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò),見圖5,該網(wǎng)絡(luò)包括13個節(jié)點(diǎn)和47條邊。在蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)中,節(jié)點(diǎn)蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的地位不同,較重要的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(keynodes)。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度參數(shù)是網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)評價的常用方法。在黃秦艽保肝作用蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)中,EGFR(11)、STAT3(10)、TNF(9)、MTOR(9)、KDR(8)、IL2(7)、MAPK8(6)、MAPK14(6)、FLT1(6)、MET(5)是度值最大的前幾個節(jié)點(diǎn),這些節(jié)點(diǎn)可能在黃秦艽防治肝損傷過程中發(fā)揮重要作用,為保肝作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。關(guān)于外部肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究黃鼠尾草可以改善細(xì)胞的活力和損傷程度通過MTT法和實(shí)時無標(biāo)記法檢測細(xì)胞活力,試劑盒檢測細(xì)胞上清液中相關(guān)酶活力指標(biāo)。結(jié)果顯示,以0.4mmol·L抗氧化反應(yīng)元件的調(diào)控通過RT-PCR法檢測氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因的相對表達(dá)量?；贜rf2是CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員,受Keap1的調(diào)控,通過與抗氧化反應(yīng)元件ARE相結(jié)合,調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時,Nrf2就會被釋放出來,進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)HO-1基因的表達(dá),從而發(fā)揮抗氧化作用,緩解肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,抑制了炎癥的發(fā)生。MAPK8是絲裂原活化蛋白激酶MAPK家族的成員,通過蛋白酶間的酶促磷酸化級聯(lián)反應(yīng)參與了生物組織器官的分化及發(fā)育調(diào)空黃秦保肝作用關(guān)鍵靶點(diǎn)分析黃秦艽是民族地區(qū)常用藥,具有清熱解毒的功效。主治肺熱咳嗽、急慢性胃炎、腸炎、慢性膽囊炎、黃疸型肝炎、癰瘡腫毒等癥首先發(fā)現(xiàn)了黃秦艽14種活性成分,并通過對這14種活性成分的潛在靶點(diǎn)和非酒精性肝損傷的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測。本研究發(fā)現(xiàn)黃秦艽活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相互作用的共同靶點(diǎn)有13個,包括EGFR,STAT3,TNF,MTOR,KDR,IL2,MAPK8,MAPK14,FLT1,MET,FGFR1,TGM2,FOLH1。并對這13個靶點(diǎn)蛋白屬性進(jìn)行歸屬,黃秦艽保肝作用靶點(diǎn)主要包括細(xì)胞生長因子、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄受體、水解酶等。基于STRING交互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建黃秦艽防治非酒精性肝損傷靶點(diǎn)交互網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)EGFR,STAT3,TNF,MTOR是網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn),這4個靶點(diǎn)有可能在黃秦艽保肝作用中發(fā)揮重要作用。EGFR是一種跨膜糖蛋白,屬于蛋白激酶家族的成員,具有誘導(dǎo)受體二聚和酪氨酸自磷酸化并導(dǎo)致細(xì)胞增殖的作用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因的突變與原發(fā)性乳腺癌發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移有關(guān)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)龍膽科植物具有顯著的保肝作用,其中對該科黃秦艽的保肝作用研究多注重于環(huán)烯醚萜苷類的藥理活性,例如sweroside,swertiamarin,gentiopicroside,amarogentin。文獻(xiàn)表明了這幾種環(huán)烯醚萜類成分對CCl本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)黃秦艽含有豐富的黃酮類化合物。有文獻(xiàn)報道黃酮類具有較強(qiáng)的保肝、抗炎等活性。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測的過程中還發(fā)現(xiàn)1,7-dihydroxy-3-methoxyxanthone、dibutylfumarate、1-hydroxy-2,3,7-trimethoxyxanthone等氧雜蒽酮為在網(wǎng)絡(luò)預(yù)測中靶點(diǎn)富集比較明顯的前3個有效化合物?；谝延形墨I(xiàn)報道有效成分1,7-dihydroxy-3-methoxyxanthone、dibutylfumarate、1-hydroxy-2,3,7-trimethoxyxanthone等氧雜蒽酮具有抗炎、預(yù)防血瘀綜上所述,本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討