ndm-1基因在不動桿菌屬菌株中的分布調(diào)查

ndm-1基因在不動桿菌屬菌株中的分布調(diào)查

nwd-1（新戴氏金屬鹽）是一種新的金屬酶基因，可以產(chǎn)生-除氨基丙烯酸-其他氨基酸-內(nèi)酰胺類抗生素。NDM-1基因一般存在于攜帶多種耐藥基因的質(zhì)粒上,從而造成菌株表現(xiàn)出多重耐藥性。該基因主要在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn),另外在一些假單胞菌和不動桿菌屬菌株中也有報道供體菌及金屬酶基因檢測收集2012年9月~2013年12月南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院臨床分離耐亞胺培南鮑曼不動桿菌25株、洛菲不動桿菌3株和瓊氏不動桿菌2株。其中痰液18份、腹水4份、膽汁3份、導(dǎo)管頭和尿液各2份、血液1份,無重復(fù)分離株。所有菌株均經(jīng)API32GN鑒定條(法國梅里埃公司)鑒定。以ATCCEscherichiacoli25922、ATCCPseudomonasaeruginosa27853、ATCCKlebsiellapneumoniae1705、ATCCKlebsiellapneumoniae1706為質(zhì)控菌株;E.coli600(利福平耐藥)為接合試驗的受體菌。TaqDNA聚合酶、10×buffer(含Mg藥敏紙片購自英國Oxoid公司,多粘菌素B及替加環(huán)素MTS(MICTestStrip,意大利Liofilchem公司)為輝瑞公司惠贈,亞胺培南E-Test為梅里埃公司產(chǎn)品。按照CLSI2014版文件EDTA紙片協(xié)同試驗0.5麥氏單位待測菌均勻涂布MH平板,分別貼兩張亞胺培南紙片,兩紙片相距25mm。在其中1張紙片上滴加500mmol/L(pH8.0)EDTA溶液5μl。35℃培養(yǎng)過夜,亞胺培南+EDTA紙片與單純亞胺培南紙片的抑菌圈直徑之差≥7mm為金屬酶陽性;改良Hodge試驗(MHT):按照CLSI2009年版進行,以ATCC1705作為陽性對照,ATCC1706作為陰性對照。挑取純培養(yǎng)菌落置0.5ml離心管內(nèi)(內(nèi)預(yù)置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl),56℃水浴2h,改95℃水浴10min,13000g離心30s。上清液即為基因檢測的模板液,置-20℃冰箱備用。采用PCR法擴增金屬酶基因(MBLs),包括IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM-1酶基因;OXA型碳青霉烯酶,包括OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like和OXA-58-like;KPC-2酶基因。參照文獻對數(shù)生長期的供體菌及受體菌(E.coli600R)各0.2ml加入0.6ml新鮮LB肉湯中,37℃過夜培養(yǎng)后,接種含亞胺培南(4mg/L)+利福平(256mg/L)的MH平板篩選接合子。供體菌和受體菌作為質(zhì)控菌。將培養(yǎng)過夜的細菌用低熔點膠灌模,蛋白酶K消化2h,限制性內(nèi)切酶ApaⅠ(30U)30℃酶切2h。使用CHEF-MapperXA型脈沖電泳儀,電壓6V/cm,夾角120o,脈沖參數(shù)5~35s,電泳19h、溫度14℃,分子量標記物為酵母染色體DNA。EB染色30min,拍照。結(jié)果判定參照Tenover標準非鮑曼不動桿菌耐藥基因檢測30株不動桿菌屬菌株對12種抗菌藥物呈現(xiàn)出多重耐藥。K-B紙片法結(jié)果顯示,鮑曼不動桿菌對米諾環(huán)素、阿米卡星的敏感率分別為36%和32%,對其余10種抗菌藥物耐藥率為100%;5株非鮑曼不動桿菌對米諾環(huán)素、阿米卡星、復(fù)方新諾明敏感,對其余藥物均耐藥;所有檢測菌株對多粘菌素敏感(MIC值均≤2μg/ml),對亞胺培南全部耐藥(MIC值均≥256μg/ml);5株非鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素全部敏感(MIC值均≤2g/ml);25株鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感20株(80%),中介5株(20%)。25株鮑曼不動桿菌的MHT試驗陽性10株,而EDTA協(xié)同試驗均陰性;5株非鮑曼不動桿菌MHT試驗均陰性,而EDTA協(xié)同試驗均陽性,提示菌株攜帶金屬酶。25株鮑曼不動桿菌OXA-23-like和OXA-51-like基因全部陽性,未擴增出金屬酶基因及OXA-24-like、OXA-58-like和KPC-2。5株非鮑曼不動桿菌所測耐藥基因中僅NDM-1兩對引物擴增結(jié)果為陽性,其余碳青霉烯酶基因均為陰性。NDM-1陽性產(chǎn)物在GenBank上比對結(jié)果顯示與肺炎克雷伯桿菌(登錄號JN677524.1)、陰溝腸桿菌(登錄號JF798502.1)和鮑曼不動桿菌(登錄號JF798501.1)的NDM-1基因同源性為100%。NDM-1PCR結(jié)果電泳圖譜及部分測序結(jié)果分別見圖1、2。25株鮑曼不動桿菌分為A(21株)、B(4株)兩個克隆株,其中A克隆可分為A1、A2、A3和A4各8株、8株、4株和1株;而3株洛菲不動桿菌和2株瓊氏不動桿菌PFGE圖譜不具同源性,見圖3。對NDM-1陽性菌株多次接合試驗均未獲成功。鮑曼不動桿菌耐藥及感染情況目前,鮑曼不動桿菌仍是院內(nèi)感染的主要病原菌。其他少見細菌如瓊氏不動桿菌、洛菲不動桿菌同樣可造成免疫低下患者的院內(nèi)感染,常見類型為導(dǎo)管相關(guān)性血流感染本調(diào)查顯示,臨床分離亞胺培南耐藥不動桿菌屬菌株對多種藥物呈現(xiàn)出耐藥性。通過表型篩選試驗提示5株非鮑曼不動桿菌菌株表達B型碳青霉烯酶,PCR及測序結(jié)果證實為NDM-1型金屬酶,而25株鮑曼不動桿菌主要攜帶OXA-23-like基因。NDM-1陽性菌株同時對喹諾酮類耐藥,而對氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類、多粘菌素B和替加環(huán)素敏感。產(chǎn)NDM-1菌株主要通過質(zhì)粒實現(xiàn)菌種之間的水平傳播,部分菌株可克隆傳播菌株同源性分析結(jié)果顯示,本院分離亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌存在以A克隆株為主的克隆播散,而NDM-1陽性非鮑曼不動桿菌菌株為散發(fā)。院內(nèi)多重耐藥鮑曼不動桿菌感染情況較嚴重,需加強院感防護,降低或杜絕院內(nèi)感染的發(fā)生。雖然非鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥分離率不高,但其攜帶NDM-1基因,仍需加強院感