蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)課件

蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)課件蛋白質(zhì)分子由兩條或兩條以上肽鏈組成，每條肽鏈各自形成了獨(dú)立的三級結(jié)構(gòu)，分子中的每一個(gè)具有獨(dú)立三級結(jié)構(gòu)肽鏈,稱為亞基亞基(subunit)2.維持蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的作用力主要是疏水作用次級鍵鹽鍵、氫鍵蛋白質(zhì)分子由兩條或兩條以上肽鏈組成，每條肽鏈各自形成了獨(dú)立的第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以124個(gè)氨基酸殘基組成的牛胰核糖核酸酶（4對二硫鍵）為例說明第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象牛胰核糖核酸酶的變性與復(fù)性β-巰基乙醇尿素或鹽酸胍透析有活性無活性牛胰核糖核酸酶的變性與復(fù)性β-巰基乙醇尿素或鹽酸胍透析有活性1.一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)功能相似一級結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)功能不同胰島素的一級結(jié)構(gòu)及種屬差異（二）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)功能相似胰島素的一級結(jié)構(gòu)及種屬差異（ACTH促腎上腺素皮質(zhì)激素MSH促黑激素一級結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)功能不同ACTH促腎上腺素皮質(zhì)激素MSH促黑激素一級結(jié)構(gòu)不同的蛋HbS與HbA的區(qū)別Β-亞基第6位氨基酸正常人：Glu患者：ValHbS與HbA的區(qū)別Β-亞基第6位氨基酸正常人：Glu患者：蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)課件由4個(gè)亞基組成血紅蛋白功能:運(yùn)輸O2由4個(gè)亞基組成血紅蛋白功能:運(yùn)輸O2二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）肌紅蛋白Mb與血紅蛋白Hb蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定生物學(xué)功能肌紅蛋白（1個(gè)亞基）與血紅蛋白（4個(gè)亞基）且一級結(jié)構(gòu)有較大差異，但均具有與氧可逆地結(jié)合的能力其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是，都與血紅素（輔基）共價(jià)結(jié)合二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）肌紅蛋白Mb與血紅蛋白蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)課件O2O2O2（二）血紅蛋白構(gòu)象變化與結(jié)合氧的能力O2（二）血紅蛋白構(gòu)象變化與結(jié)合氧的能力變構(gòu)效應(yīng)蛋白質(zhì)分子與它的配體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化,其功能也隨之變化的現(xiàn)象,稱為變構(gòu)效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)蛋白質(zhì)分子中的1個(gè)亞基與其的配體結(jié)合后,能影響其它亞基與配體的結(jié)合,稱為協(xié)同效應(yīng)促進(jìn)正協(xié)同效應(yīng)抑制負(fù)協(xié)同效應(yīng)變構(gòu)效應(yīng)蛋白質(zhì)分子與它的配體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化,其功能也隨之血紅蛋白與氧結(jié)合的正協(xié)同效應(yīng)氧飽和度靜脈血?jiǎng)用}血氧分壓P50100%-HbMb血紅蛋白與氧結(jié)合的正協(xié)同效應(yīng)氧飽和度靜脈血?jiǎng)用}血氧分壓P50第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）兩性解離和等電點(diǎn)第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）兩性解蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在溶液中的帶電狀況主要取決于溶液的pH值PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2+OH-+H++OH-+H+pH=pIpH<pIpH>pI此時(shí)溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)等電點(diǎn)（pI）：在某一pH值溶液中，蛋白質(zhì)酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的解離程度相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為零蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在溶液中的帶電狀況主要取決于溶液的pH值蛋白質(zhì)分子顆粒大小1-100nm之間,屬膠體顆粒范圍，在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體蛋白質(zhì)的膠體原因：表面形成水化層表面同種電荷的斥力（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子顆粒大小1-100nm之間,屬膠體顆粒范圍，在溶液蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)的聚沉（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀與凝固變性后的蛋白稱為變性蛋白質(zhì)1.蛋白質(zhì)的變性作用在某些理化因素作用下.蛋白質(zhì)的構(gòu)象被破壞，失去其原有的性質(zhì)和生物活性，稱為蛋白質(zhì)的變性作用(denaturation)概念:（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀與凝固變性后的蛋白稱為變性蛋常見的變性因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、尿素、胍、重金屬生物堿、化學(xué)因素物理因素劇烈振蕩熱、紫外線、超聲波、常見的變性因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、尿素、胍、重金屬生物堿變性蛋白質(zhì)的主要特征:（2）生物活性喪失（4）變性蛋白質(zhì)容易消化（1）蛋白質(zhì)分子中的次級鍵斷裂,構(gòu)象破壞，但不涉及共價(jià)鍵的破壞,一級結(jié)構(gòu)不變（3）變性蛋白質(zhì)的溶解度常降低、粘度增加、擴(kuò)散系數(shù)減小變性蛋白質(zhì)的主要特征:（2）生物活性喪失（4）變性蛋白質(zhì)除去變性因素后，有的變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性，這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation)除去變性因素后，有的變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性，當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀(pre-cipitation)概念:應(yīng)用:(1)蛋白質(zhì)分離純化(2)解毒(3)臨床檢驗(yàn)當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時(shí)，蛋白質(zhì)就(1)鹽析法(saltingout)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀稱為鹽析常用的中性鹽：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)不發(fā)生變性硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等使蛋白質(zhì)沉淀的方法概念：特點(diǎn)：作用原理:鹽離子與水親和力極強(qiáng)，奪去蛋白質(zhì)的水化層，減少分子間靜電斥力(1)鹽析法(saltingout)向蛋白質(zhì)溶液中加(2)有機(jī)溶劑沉淀法使蛋白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介電常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀

必須在低溫下操作注意事項(xiàng):盡量縮短處理的時(shí)間

及時(shí)將蛋白質(zhì)中殘存的有機(jī)溶劑除去甲醇、乙醇、丙酮缺點(diǎn)：原理:常用有機(jī)溶劑:常會(huì)使蛋白質(zhì)變性(2)有機(jī)溶劑沉淀法使蛋白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介重金屬離子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等帶有正電荷，能與蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電的基團(tuán)結(jié)合，生成不溶性的重金屬蛋白鹽而沉淀(3)重金屬鹽沉淀法此法常使蛋白質(zhì)變性失活若溶液pH大于蛋白質(zhì)的pI，沉淀更易發(fā)生缺點(diǎn)：原理:重金屬離子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等帶有正電生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等)，某些酸類(主要是指三氯醋酸、磺酰水楊酸和硝酸等)，與帶正電的蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性的鹽而沉淀(4)生物堿試劑和某些酸類沉淀法反應(yīng)溶液的pH<pI，確保蛋白質(zhì)以陽離子形式存在

缺點(diǎn)：原理:常引起蛋白質(zhì)變性注意事項(xiàng):生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等)，某些酸類(主要是指三氯3.蛋白質(zhì)的凝固作用蛋白質(zhì)的凝固作用實(shí)際上是蛋白質(zhì)變性后進(jìn)一步發(fā)展的不可逆結(jié)果如加熱可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗菰偃芙獾哪龎K3.蛋白質(zhì)的凝固作用蛋白質(zhì)的凝固作用實(shí)際上是蛋白質(zhì)變性后二、蛋白質(zhì)的分離純化(一)鹽析和有機(jī)溶劑沉淀(二)電泳(三)透析和超濾(四)層析(五)超速離心二、蛋白質(zhì)的分離純化(一)鹽析和有機(jī)溶劑沉淀(二)分類：根據(jù)支持物的不同，電泳電泳可分為：薄膜電泳、凝膠電泳……

（二）電泳概念：帶電顆粒在電場中向著所帶電荷相反方向移動(dòng)稱為電泳。原理:不同的蛋白質(zhì)的因結(jié)構(gòu)、形狀和帶電量的不同而有不同的泳動(dòng)速度，從而達(dá)到分析和分離蛋白質(zhì)的目的應(yīng)用：電泳技術(shù)是生化常用分析技術(shù)之一分類：根據(jù)支持物的不同，電泳電泳可分為：（二）電泳概念利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過超濾膜(一種半透膜)除去，而蛋白質(zhì)留在膜上，稱為超過濾將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜的袋內(nèi)，置于流動(dòng)的適當(dāng)?shù)木彌_液（如純水）中，小分子雜質(zhì)（如硫酸銨、氧化鈉等）從袋中透出，而蛋白質(zhì)保留于袋中從而將蛋白質(zhì)純化，這種方法稱為透析（三）透析利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過超濾膜(一種半透膜)透析工作圖半透膜原理透析工作圖半透膜原理層析種類：凝膠過（分子篩）離子交換層析（陰離子和陽離子）親和層析(四)層析層析種類：(四)層析帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合帶負(fù)電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂工作示意圖帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合帶負(fù)電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂分子篩層析分子篩層析蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)課件親和層析工作示意圖蛋白質(zhì)載體介質(zhì)配體結(jié)合洗脫洗脫介質(zhì)親和層析工作示意圖蛋白質(zhì)載體介質(zhì)配體結(jié)合洗脫洗脫介質(zhì)(六)超速離心(六)超速離心三、多肽鏈中氨基酸的順序分析第一步：

分離提純蛋白質(zhì)，測定NH2末端的數(shù)目，確定蛋白質(zhì)分子是由幾條肽鏈構(gòu)成的，并分離出每條肽鏈。測定肽鏈的分子量,計(jì)算組成該肽鏈的氨基酸殘基數(shù)。及每種aa的百分組成。一般過程：肽鏈分子中氨基酸殘基數(shù)=肽鏈的分子量÷120

（各種的氨基酸殘基的平均分子量為120）再將肽鏈徹底水解，用離子交換層析法將各種的氨基酸分離三、多肽鏈中氨基酸的順序分析第一步：分離提純蛋白質(zhì)，測定a.丹磺酰氯法

丹磺酰氯是一種強(qiáng)熒光劑，它能專一地與鏈N-端α-氨基反應(yīng)生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很強(qiáng)的熒光，可直接用電泳法或?qū)游龇ㄨb定出N-端是何種氨基酸。第二步測定肽鏈的氨基末端和羧基末端1.N末端的測定b.二硝基苯氟法：過時(shí)a.丹磺酰氯法第二步測定肽鏈的氨基末端和羧基末端1.2.C末端的測定常用羧基肽酶法羧基肽酶專一地將肽鏈水解成片斷，分別進(jìn)行順序分析2.C末端的測定常用羧基肽酶法羧基肽酶專一地將肽鏈水第三步肽鏈的局部水解胰蛋白酶的作用原理1.酶解法第三步肽鏈的局部水解胰蛋白酶的作用原理1.酶解法CNBr與Met反應(yīng)測定Pr的一級結(jié)構(gòu)

2.化學(xué)法CNBr與Met反應(yīng)測定Pr的一級結(jié)構(gòu)2.化學(xué)法層析鑒定就可N-端開始確定被測肽段的氨基酸排列順序第四步肽段氨基酸順序分析一般采用Edman降解法弱堿條件異硫氰酸苯酯+N端α-氨基苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽）酸性條件環(huán)化水解苯乙內(nèi)酰硫氨基酸(PTH-aa)失去原N-端氨基酸的肽剩下的肽可反復(fù)進(jìn)行上述處理，依次生成各種PTH-aa，層析鑒定就可N-端開始確定被測肽段的氨基酸排列順序第四步Edman降解法的示意圖Edman降解法的示意圖

一般常用多種方法使肽鏈斷裂，并分析出各肽段中的氨基酸順序。由于在不同部位斷鏈，只要找出多套肽段的重疊部位，然后組合排列對比，即可推斷肽段的排列順序，從而得出完整肽鏈中氨基酸的順序第五步肽鏈一級結(jié)構(gòu)的確定一般常用多種方法使肽鏈斷裂，并分析出各肽段中的氨基酸順則其氨基酸排列順序?yàn)椋?/p>

Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys如測一個(gè)九肽測得N端氨基酸殘基為Thr又分別測得片段:

Ala-Ala-Trp-Gly-Lys

Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys另外，亦可以通過基因中核苷酸順序推測蛋白質(zhì)的氨基酸順序則其氨基酸排列順序?yàn)椋喝鐪y一個(gè)九肽測得N端氨基酸殘