HPLC使用注意事項(xiàng)及HPLC柱子使用經(jīng)驗(yàn)之談

注意事項(xiàng)：1■流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)（使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾）。2■流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。4■使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇（或甲醇水溶液）沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。5■長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相（如甲醇等），因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉。每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。8■堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱一混合器中的過(guò)濾器一管路過(guò)濾器一單向閥檢查并清洗。清洗方法；①以異丙醇作溶劑沖洗：②放在異丙醇中間用超聲波清洗；⑧用10%稀硝酸清洗。氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。高效液相色譜常見(jiàn)故障的斷定及解決診狀可能的原因解決方法（一）保留時(shí)間變化1■柱溫變化柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱2■等度與梯度間未能充分平衡至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱緩沖液容量不夠用》25mmol/L的緩沖液柱污染每天沖洗柱柱內(nèi)條件變化穩(wěn)定進(jìn)樣條件，調(diào)節(jié)流動(dòng)相6?柱快達(dá)到壽命采用保護(hù)柱（二）保留時(shí)間縮短流速增加檢查泵，重新設(shè)定流速2■樣品超載降低樣品量鍵合相流失流動(dòng)相PH值保持在3"7.5檢查柱的方向流動(dòng)相組成變化防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀溫度增加柱恒溫（三）保留時(shí)間延長(zhǎng)1■流速下降管路泄漏，更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2■硅膠柱上活性點(diǎn)變化用流動(dòng)相改性劑，如加三乙胺，或采用堿至鈍化3■鍵合相流失同前（二）34■流動(dòng)相組成變化同前（二）45■溫度降低同前（二）5（四）出現(xiàn)肩峰或分*樣品體積過(guò)大用流動(dòng)相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%2■樣品溶劑過(guò)強(qiáng)采用較弱的樣品溶劑3■柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4■柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器，過(guò)濾樣品5■進(jìn)樣器損壞更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子（五）鬼峰1■進(jìn)樣閥殘余峰每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗2■樣品中未知物處理樣品3■柱未平衡重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜）三氟乙酸（TFA）氧化（肽譜）每天新配，用抗氧化劑水污染（反相）通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水（六）基線噪聲氣泡（尖銳峰）流動(dòng)相脫氣，加柱后背壓2■污染（隨機(jī)噪聲）清洗柱，凈化樣品，用HPLC級(jí)試劑3■檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲更換氘燈4■電干擾（偶然噪聲）采用穩(wěn)壓電源，檢查干擾的來(lái)源（如水浴等）5.檢測(cè)器中有氣泡流動(dòng)相脫氣，加柱后背壓（七）峰拖尾1?柱超載降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相峰干擾清潔樣品，調(diào)整流動(dòng)相3■硅羥基作用加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值，鈍化樣品4■同前（四）4同前（四）45■同前（四）35■同前（四）36■死體積或柱外體積過(guò)大連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7■柱效下降用較低腐蝕條件,更換柱，采用保護(hù)柱（八）峰展寬1■進(jìn)樣體積過(guò)大同（四）12?在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散3■數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)4■檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%5.流動(dòng)相粘度過(guò)高增加柱溫，采用低粘度流動(dòng)相6■檢測(cè)池體積過(guò)大用小體積池,卸下熱交換器7?保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫8?柱外體積過(guò)大將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小9■樣品過(guò)載進(jìn)小濃度小體積樣品經(jīng)驗(yàn)談：色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。1、樣品的前處理：a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45祄的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。2、流動(dòng)相的配制：液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中（或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中）。b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。2、流動(dòng)相流速的選擇：因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min,對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。注意：由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的場(chǎng)合除外）。對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60°C的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水（電阻率大于18兆歐），去離子水及雙蒸水中含有酚類(lèi)雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。含水流動(dòng)相最*在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。流動(dòng)相要求使用0.45祄濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能HPLC的常用術(shù)語(yǔ)第一部分色譜曲線1、romatogram）:色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或流動(dòng)相流出體積的曲線圖，或者通色譜圖（ch過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ^察到的紙色譜或薄層色譜斑點(diǎn)、譜帶的分布圖。2、（色譜）峰（chromatographicpeak）:色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線。此主題相關(guān)圖片如下：此主題相關(guān)圖片如下：3、峰底（peakbase）:峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的連接的直線（圖1中的CD）。4、峰高（h，peakheight）:色譜峰最大值點(diǎn)到峰底的距離（圖1中的BE）。5、峰寬（W，peakwidth）:在峰兩側(cè)拐點(diǎn)（圖1中的F，G）處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)的距離（圖1中的KL）。6、半高峰寬（Wh/2，peakwithdathalfheight）:通過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離（圖1中的HJ）。7、峰面積（A，peakarea）:峰與峰底之間的面積（圖1中的CHEJDC）。&拖尾峰（tailingpeak）:后沿較前沿平緩的不對(duì)稱的峰。9、前伸峰（leadingpeak）:前沿較后沿平緩的不對(duì)稱的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（ghostpeak）:除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來(lái)誤差。（又叫鬼峰）11、畸峰（distrortedpeak）:形狀不對(duì)稱的色譜峰，前伸峰、拖尾峰都屬于這類(lèi)。12、反峰（negativepeak）:也稱倒峰、負(fù)峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)（推薦）色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。2■應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH）,以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50"75ml。下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100"200祃四氫咲喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫咲喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類(lèi)脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。陽(yáng)離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開(kāi)柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1"2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5"30mm），可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH