八、檢測口蹄疫病毒抗原的方法

八、檢測口蹄疫病毒抗原的方法（一）口蹄疫反向被動紅細胞凝集試驗（反向被動血凝）紅細胞膜具有吸附抗原或抗體的特性將提純的口蹄疫抗（I在pH4.0醋酸緩沖液中致敏綿羊紅細胞當這種被致敏的紅細（即紅細胞表面均帶有口蹄疫抗體，遇到相應的口蹄疫病毒抗原時，便產生抗原抗體的特異性反應，從口。o．驗材料型9孔1凝滴定板、玻璃吸管（毫升、毫升規(guī)格、玻璃中試管o（內徑1毫米，長度1米、試管架、微量振蕩器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（與血凝板大小一致、口蹄疫、、、AsiS豬水泡?。┓聪虮粍友\斷試劑及其配套用的口蹄疫各型豬水泡病陽性抗原陰性抗原、稀釋液、待檢抗原。２．試驗方法（）釋抗原取中試管支，橫列于試管架上，每管各加入稀釋液1毫升取待檢抗原毫升加入第管混勻后從中取出毫升加入第管混勻后取毫升加入第管??直至第管，此時待檢抗原的稀釋度依次為：、：1、：2、：4、：9、：1：3：78原取中試管支用記號筆標明“陰抗”字樣，加入稀釋液3升，加入陰性抗原1微升，充分混勻，此時陰性抗原的稀釋度為：4。（３）稀釋陽性抗原取中試管2支，橫列于管架標明“陽抗”字樣，每排支（型支、型支、型支、Asi支、SV。每種陽抗第管，加稀釋液4升，第~管各加稀釋液0升。取型陽性抗原0.1毫升(1升加入第排的第管中混勻后取出0升，加入第排的第2管并充分混勻取出0升加入第排的第管混勻后取出0升加入第1排的第管并混勻。其他陽性抗原均按上法稀釋注意每稀釋一種陽抗必須更換支吸管切勿混雜以免影響反應的特異性經過上述稀釋各陽性抗原的稀釋度依次為4、：9、：12：3用于陽抗對照孔的只加第管（：3的陽抗。原取第管稀釋的待檢抗原（：7加入血的~排的第孔，每孔5微升，取第管待檢抗原（：3加入~排的第孔，取第管待檢抗原（：1加入~排的第孔??直至第孔，每孔均為5微升。~排的第1孔加入：4的陰性抗原，每孔50微升。1的第1孔依次加入、、、Asia-SVD184釋度的陽性抗原，每孔5微升（即第排的第1孔加型抗原；第排的1孔加型抗原；第排的1孔加型抗原；第排的1孔加As–型抗原；第排的1孔加S原。1的第1孔各加稀釋液5微升作為稀釋。（５）滴加反向被動血凝診斷液血凝板上的第1排~8孔和1~1孔加O型診斷液，每孔2微升。第排~孔和1~1孔加入型診斷液，每孔25微升。第排~孔和1~1孔加入型診斷液，每孔2微升。第排~孔和1~1孔加入Asi斷液，每孔2微升。第5排~8孔和1~1孔加入S斷液，每孔2微升。板振蕩3秒，取下血凝板放在白紙上觀察各孔的紅細胞是否均勻懸浮，孔底應無紅，充。置將混勻的血凝板，蓋上玻璃板后靜置小時，判定檢測結第天判定。３．判定標準先觀察血凝板上~排的1~1孔，每排的第1孔為陰性抗原對照孔，應無凝集現象，紅細胞應全部沉入孔底，形成邊緣整齊的小圓點；每排的1孔為陽性抗原對照孔，應出現“++~“”的凝集現象（即有510紅細胞發(fā)生凝集，紅細胞懸于孔中，不沉入孔底，證明所加的反向診斷液效價不低于：3用于檢測抗原合格；每排的第1孔為稀釋液對照孔，也應無凝集現象，紅。在上述對照孔判定合格的前提下，仔細觀察血凝板上的~排的~孔，某排~孔或~孔均有“+”“凝集現象而其余排僅在~孔出“”~“++的凝集，即可判定該份待檢抗原為陽性。其型別與所加的反向診斷液的型別相同比如第排~孔出“+以上的紅細胞凝集第~排無此現象，便可判定該待檢抗原為型口蹄疫。以出現“+”以上凝集的待檢抗原最大稀釋度為其抗原滴度。例如第排的~孔出現“”凝集，第孔出現“+凝集第孔出現“+”凝集，第孔出現“”凝集，第孔無凝集現象，即判定該待檢抗原為型，滴度為：192（以第孔出現“+”凝集為滴度的終點。o o４．注意事項（１）勿用9和11血凝板，防止o o（２陰性抗原陽性抗原和稀釋液孔對照全部或部分出現不合格時檢測結果不能判定，應更換試劑重新檢測，以免錯判。（３）嚴重腐敗變質的病料不宜檢測，以防非特異反應。（４）病料太少，無法檢測時，可制成：1或：2懸液，先接種~日齡小白鼠，連傳代后，用鼠組織制成待檢抗原，再進行檢測。（５）檢測過程中，有時出現前帶現象，即第孔或第孔的紅細胞沉淀形成小園點第孔以后又出“+以上的凝集這是因為抗原抗體比例失調所致，不結。反向被動紅細胞凝集試驗的診斷液及其配套試劑由中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所供應。（二）口蹄疫微量補體結合試驗補體的作用是無特異性的，它能與任何一組抗原抗體復合物結合并不再游離。但不能單獨與抗原或抗體結合。當抗原與其相應的抗體結合成復合物之后，可與補體結合但這種反應不能用肉眼觀察如果抗原是紅細胞與其相應抗（溶抗。血反應作為指示劑以檢驗補體是否已被前一種抗原抗體系統(tǒng)所結合這種試驗叫做補體結合試驗前者稱為溶菌系統(tǒng)或試驗系統(tǒng)后者稱為溶血系統(tǒng)如果溶菌系統(tǒng)的抗原抗體是相應的，則補體被結合，加入溶血系統(tǒng)后不發(fā)生溶血。反之，二者不對應，則補體游離，加入溶血系統(tǒng)后發(fā)生溶血。所以在補體結合試驗中，溶血判為陰性；不溶血則判為陽性。操作步驟如下：１．測定溶血素效價（）取試管1支列于管架上，~1管內各加生理鹽水0升（）取溶血素0升加生理鹽水9升=1:血素。（）?。?溶血素毫升加生理鹽水毫升=15血素。（）?。?溶血素0升加入第管混勻并取出0升加入第管混勻，并取出0升加入第管??以此類推，直至第管。并取出0.5毫升棄去，~管的溶血素稀釋度依次為：1~80、1管為對照管。（）將補體（豚鼠血清）用生理鹽水稀釋成：1，~管各加0升，第1管不加補體而加：5溶血素0升。（）將洗凈的紅細胞沉淀用生理鹽水配成2%度，~1管各加0升。（）每管充分混勻置37水浴中作用2分鐘后判定效價。（）以出現完全溶血的溶血素最大稀釋度為其效價。素滴劑升）試管號理水：50血素

1 2 3 4 5 6 70.50.50.50.50.50.50.50.5補（1）溶血素)紅細胞（2%

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5℃2分鐘定價 ———— +

37++＃+++按此表滴度結果，該溶血素效價＝：4作濃度為效價的倍即：100．測定補體效價溶出補補被，容易失效，宜用10%即補體1份十10%Nacl混1后置℃或-貯存有效期~個月。取保存補體毫升加生理鹽水毫升=：1的補體。按量。體價定表 （劑量毫升）試管號 1 2 3 48生理鹽水 0.05 0.1 0.15 0.20.4補體（：1） 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25溶血素（工0.50.50.50.50.5濃）紅細（2） 0.5 0.5℃3分鐘

0.5 0.5 0.537判定 — — — + +＃ +++＃全大價。按此表測出的該補體效價為0.，工作濃度為0.。5以上和兩步驟稱為預備試驗，溶血素一般半年滴定一次。而補體則必須。．標準血清（已知陽性血清）用生理鹽水稀釋成：（陰性血清毫升加生理鹽水毫升。標準血清的補反效價必須達到：8以上。．9孔或2孔型微量滴定板上，~排的~孔，各滴滴（約50。①將待檢抗原稀釋成：、：、：1和：2，分別滴入~排的~4孔，每孔滴（約2微升。②第1的第孔滴入陰性抗原各滴~排的第孔依次分別滴入、、、AsiS性抗原滴，~排的第孔各滴入鹽水滴作為陰。③~排的~孔依次分別加入、、、AsiS準清滴（25微。④~排的~孔各加補體工作濃度滴（5微升。⑤微量振蕩器上振蕩分鐘，37溫箱保溫4分鐘。⑥每孔各加溶血素工作濃度滴。⑦每孔各加2%細胞滴。⑧振蕩器上振蕩一分鐘，37溫箱3分鐘后判定結果。．判定標準：先檢查對照孔，第和第孔應完全溶血為合格；第~排的第~孔中任一孔呈現不溶血則判該份待檢抗原為陽性其型別與所加標準血清的型別相同。該法操作較繁瑣，敏感性低，但特異強。（三）口蹄疫酶聯免疫吸附試驗（ELSA八十年代以來，國外常采用EL口蹄疫和豬水泡病病毒。國內也有人試用該法對FMS行檢測，由于I純度不高，經常出現非特異性反。EL雖然多種多樣，但一般以雙抗體夾心法居多。用最適濃度抗口蹄疫血清的I被酶標板孔℃過夜，經洗滌后加入待檢抗原3℃保溫小時，洗滌后再加辣根過氧化物酶標記的兔抗豚鼠血清的IgG℃保溫1小時，洗滌后加底物溶液（鄰苯二胺和，3分鐘后用2M中止反應，751分光22 24光度計49光密值或在酶標檢測儀上直接測定。陽性O值為0~09陰性O值為0~03（四）免疫熒光直接檢檢測口蹄疫帶毒肉品的操作方法．驗材料（）熒光顯微鏡及自動照相裝置 臺1（）冰凍組織切片機 臺 1（）電熱恒溫箱 臺1（）玻璃染色缸 具2（）玻璃片 盒5（）組織切片盒 個2（）抗體（型、型、Asi型、SD種）（）0.01MBS（）丙酮（10伊文斯蘭（萬分之二濃度）．作方法（）剝離淋巴結周圍的脂肪及被膜，將淋巴結剪成長1~2寬0~1cm厚0~.5cm織塊。（）在冷凍組織切片機上，低溫切成~微米的薄片，每份淋巴結切片8。（）冷丙酮固定（室溫下2分鐘或在℃下3分鐘。（）0.01M~洗次，每次分鐘，用濾紙吸去樣品周圍水。（）滴加熒光抗體工作液，以復蓋樣品為度，置溫盒3℃溫箱保溫3分。（）PS次，濾紙吸水并吹干。（）熒光顯微鏡下觀察。．判定標準（）先判定已知陰性淋巴結切片染色結果僅見組織細胞的輪廓應無翠綠色光點出現，或見少數（視野內少于個）橙黃色小點，視為合格。（）細胞質內出現成堆的有時呈放射狀翠綠色亮點，判為“；胞質內出現個以上翠綠色熒光點為“+胞質內出現~個綠色熒光點為“+；視野見~“”。（）出現“+”以上（含“+）的熒光判為陽性“”判為可疑“—”為陰性。．意事項（）根據本地及鄰近地區(qū)的疫情，認為有必要時，每份樣品應切片張，每種熒光抗體染色張切