加味濟生腎氣湯對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化的影響

加味濟生腎氣湯對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化的影響

近年來，隨著生活質(zhì)量的提高，糖尿病發(fā)病率逐年增加。預(yù)計世界上受糖尿病影響的成人糖尿病患者數(shù)量預(yù)計在20.39億人。1材料和方法1.1藥材、藥物等用量于湖北省疾病預(yù)防控制中心購置66只SPF級雌性SD大鼠，體重為（226.7±17.5)g，月齡3個月（合格號：NO.42000600026493）。中藥材購自武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，加味濟生腎氣湯藥物組成：肉桂6g、制附片8g、熟地黃15g、山藥25g、山茱萸15g、茯苓20g、澤瀉8g、牡丹皮8g、懷牛膝15g、車前子10g、黃芪25g、熟大黃8g、桃仁10g。取水1000mL浸泡藥材，文火煎煮30～40min，留200mL藥液備用。伊紅、蘇木素染液購自北京索萊寶科技有限公司；二甲苯、無水乙醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；羥苯磺酸鈣片購自南京長澳制藥有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（smoothmuscleactin,SMA）、母親DPP同源物3(motheragainstdecapentaplegichomolog3,Smad3）、I型膠原（collagentypeI,Col-I）、Col-III、轉(zhuǎn)化生長因子（transforminggrowthfactor,TGF）-β、血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）試劑盒購自武漢Bioswamp。1.2動物造模及高糖高脂飼料治療所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機分為對照組、模型組、羥苯磺酸鈣組及加味濟生腎氣湯低、中、高劑量組，每組11只。對照組大鼠采用普通飼料正常喂養(yǎng)；模型組及各藥物治療組大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料5周后，禁食12h,STZ腹腔注射，25mg/（kg·d），連續(xù)3d。造模成功后，加味濟生腎氣湯低、中、高劑量組大鼠分別予以加味濟生腎氣湯1、4、10mL/（kg·d）灌胃處理；羥苯磺酸鈣組大鼠羥苯磺酸鈣100mg/（kg·d）灌胃處理；對照組及模型組等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃處理；各組大鼠連續(xù)灌胃6周，1次/d。1.3鹽酸乙醇分離率大鼠腎臟組織脫水、包埋、切片。經(jīng)蘇木精染液染核7min后流水沖洗2h。1%的鹽酸乙醇分化3s，伊紅染液染色5～10min。用95%乙醇和無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。1.4masn染色腎臟組織脫水、包埋、切片。經(jīng)蘇木精染核5～10min，充分水洗，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色5～10min，冰醋酸水溶液浸洗，分化。苯胺藍染色，浸洗。脫水透明后封固。1.5酶標試劑封板繪制標準曲線，設(shè)標準品孔，加標準品，加樣，加抗體。加入酶標試劑，封板后溫育。揭板膜，棄去液體，甩干，洗滌靜置，如此重復(fù)5次，拍干。加顯色劑輕輕震蕩混勻，避光顯色后加終止液，檢測450nm處的吸光度。1.6統(tǒng)計方法采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（2結(jié)果2.1小鼠肝腎組織病理學(xué)檢測HE染色結(jié)果顯示對照組腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)規(guī)則，未見明顯病理變化。模型組腎小球體積增加，系膜細胞和系膜基質(zhì)增生，系膜區(qū)變寬，基底膜增厚，毛細血管環(huán)增多，腎小球系膜區(qū)大量炎性細胞浸潤；腎小管上皮細胞腫脹、融合、壞死。羥苯磺酸鈣組及加味濟生腎氣湯中、高劑量組腎組織形態(tài)均得到不同程度改善。見圖1。2.2腎組織病理學(xué)檢測Masson染色結(jié)果顯示對照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)未見異常。與對照組比較，模型組和加味濟生腎氣湯低劑量組腎小管間質(zhì)和腎小球周圍呈現(xiàn)膠原堆積，存在明顯纖維化現(xiàn)象。與模型組相比，羥苯磺酸鈣組及加味濟生腎氣湯中、高劑量組腎小管間質(zhì)纖維化程度降低。見圖2。2.3ff水平與對照組比較，模型組大鼠腎組織α-SMA、VEGF水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，羥苯磺酸鈣組及加味濟生腎氣湯高劑量組大鼠腎組織α-SMA、VEGF水平著降低（P<0.05）。見圖3。2.4iii及col-i水平與對照組比較，模型組大鼠腎組織Smad3、TGF-β、Col-III及Col-I水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，羥苯磺酸鈣組及加味濟生腎氣湯低、中、高劑量組大鼠腎組織Smad3、TGF-β、Col-III、Col-I水平均顯著降低（P<0.05）。見圖4。3腎間質(zhì)纖維化DN是一種臨床常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，在高血糖的長期作用下，腎臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白尿、高血壓和腎功能進行性降低。腎間質(zhì)纖維化為各種腎臟疾病進展到終末期的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，由各種原因引起的細胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)過度沉積和間質(zhì)成纖維細胞增生而形成α-SMA是腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程中的重要標志物，由肌成纖