遺傳學課件：克隆載體

基因工程中的載體

—克隆載體克隆載體具備的3個特點1、具有一個復制起點，能獨立于宿主細胞進行自主復制2、含有篩選標記，便于鑒別陽性重組子3、含有一個或多個限制酶的單個酶切位點，從而使目的基因插入載體的特定位點克隆載體的種類1、質粒2、噬菌體載體3、黏粒4、噬粒5、人工染色體6、其他（動植物病毒等）克隆載體的種類1、質粒2、噬菌體載體3、黏粒4、噬粒5、人工染色體1、質粒載體——復制起點來自一些天然質粒質粒的特點：大?。?-200kb存在于細菌中，偶見于鏈霉菌和酵母獨立于染色體之外進行復制和遺傳,又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質來進行復制和轉錄。比病毒還簡單的亞細胞結構，一旦離開寄主細胞則無法繁殖。1、質粒載體——復制起點來自一些天然質粒常用的兩種質粒：PBR322質粒和PUC質粒（1）PBR322質粒概念：質粒載體PBR322是研究得最多，使用最早且應用最廣泛的大腸桿菌質粒載體之一。符號質粒載體pBR322中的“p代表質粒；“BR”代表兩位兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是實驗編號。

1、質粒載體——復制起點來自一些天然質粒（1）PBR322質粒優(yōu)點：1、質粒載體pBR322的大小為4361bp,相對分子質量較小。2、2、它帶有一個復制起始位點，保證了該質粒只在大腸桿菌的細胞中行使復制的功能。3、具有兩種抗生素抗性基因（氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因），可供轉化子的選擇標記（負選擇法）。

4、質粒載體pBR322具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增以后，每個細胞中可累積1000-3000份拷貝，該特性為重組體DNA的制備提供了極大的方便。1、質粒載體——復制起點來自一些天然質粒（2）PUC質粒（PBR322的衍生質粒）與PBR322的異同：（1）PUC質粒保持了PBR322的復制起點（2）保留了氨芐青霉素抗性基因（3）增加了大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子和LacZ基因部分區(qū)段（可產(chǎn)生α肽）（4）新增了多克隆位點1、質粒載體——復制起點來自一些天然質粒（2）PUC質粒（PBR322的衍生質粒）PUC質粒通過藍白斑實驗選擇重組子經(jīng)IPTG誘導LacZ酶催化X-gal后會使菌落變藍，當外源基因插入目的基因多克隆位點之后，破壞了α肽的功能，該產(chǎn)物不能與宿主LacZ的N端有缺失的產(chǎn)物發(fā)生α互補，無LacZ酶活性，因此不能使X-gal變藍，仍為白色菌落?？寺≥d體的種類1、質粒2、噬菌體載體3、黏粒4、噬粒5、人工染色體2、噬菌體載體重組DNA技術中常用的噬菌體克隆載體主要有λ類噬菌體和M13噬菌體構建λ噬菌體載體的基本原理是多余限制位點的刪除，按照這一基本原理構建的λ噬菌體的派生載體，可以歸納成兩種不同的類型：一種是插入型載體（insertionvectors），只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點。插入型載體只能承受較小分子量（一般在10kb以內）的外源DNA片段的插入，廣泛應用于cDNA及小片段DNA的克隆。另一種是替換型載體（rePlacementvectors），具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體DNA。2、噬菌體載體噬菌體載體和質粒載體優(yōu)缺點比較：（1）噬菌體文庫比質粒文庫克隆容量大一倍；（2）噬菌體載體感染包裝效率更高；（3）質粒DNA提取較為方便?？寺≥d體的種類1、質粒2、噬菌體載體3、黏粒4、噬粒5、人工染色體3、黏粒——帶有黏端位點(cos)的質粒黏粒是由人工構建的含有λ噬菌體DNA的cos序列和質粒復制子的載體。黏粒的組成包括質粒復制起點（ColE1）、氨芐青霉素抗性標記、cos位點。黏粒有4個特點：①具有λ噬菌體的特性。黏粒在克隆了外源DNA在體外包裝成噬菌體顆粒后，可以感染宿主菌并在細菌內按照λ噬菌體DNA的方式環(huán)化起來。但黏粒載體不含有λ噬菌體的全部必要基因，因此不會使宿主菌裂解，無法形成子代噬菌體顆粒。②具有質粒的特性。黏粒具有質粒復制子，可在宿主菌內像質粒DNA一樣進行復制。③克隆外源DNA的容量大。黏粒自身相對較小，一般只有5～7kb，而最大的克隆片段可達45kb左右。④能與有同源序列的質粒進行重組?？寺≥d體的種類1、質粒2、噬菌體載體3、黏粒4、噬粒5、人工染色體4、噬粒噬粒(phagemid或phasmid)是由質粒載體和單鏈噬菌體載體構建成的。它們既有質粒的復制起點，又有噬菌體的復制起點。同時具有噬菌體和質粒的性質。在大腸桿菌細胞里，可以按正常的雙鏈質粒分子進行復制，生成雙鏈DNA；當存在輔助噬菌體的條件時，在噬菌體基因Ⅱ蛋白質的作用下，又可像單鏈噬菌體M13一樣按滾環(huán)模型復制出單鏈DNA，并在包裝成噬菌體顆粒后釋放出宿主細胞?？寺≥d體的種類1、質粒2、噬菌體載體3、黏粒4、噬粒5、人工染色體5、人工染色體（1）細菌人工染色體（BAC）

該系統(tǒng)的復制子來源于大腸桿菌等F因子，在細胞內只有1-2個拷貝，質粒本身只有幾kb到20kb，但可以克隆的外源DNA的長度達100~300kb。（2）酵母人工染色體（YAC）

是由天然的自主復制區(qū)、端粒區(qū)、著絲粒區(qū)和外源DNA插入