桃對不同光周期條件滯育的種群遺傳特性

桃對不同光周期條件滯育的種群遺傳特性

這種緩慢繁殖通常是由昆蟲對不利環(huán)境的改變引起的一種信號刺激，這些信號刺激會導(dǎo)致一些特定基因和蛋白質(zhì)的編碼過程，并導(dǎo)致生長發(fā)育和生殖停滯。這是一個漫長的發(fā)展過程，通過昆蟲對環(huán)境條件的適應(yīng)性來選擇昆蟲個體形成的遺傳特征。在昆蟲中，咽側(cè)體(corporaallata，CA)合成的保幼激素(Juvenilehormone，JH)與前胸腺(prothoracicglands，PG)合成的20羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)是兩種最重要的激素，兩者動態(tài)調(diào)節(jié)著幼蟲生長和變態(tài)發(fā)育。幼蟲滯育已有的理論認(rèn)為，幼蟲血淋巴高水平的JH在滯育過程中抑制了腦―前胸腺軸的活化，阻止了20E合成釋放，從而導(dǎo)致幼蟲生長停滯和化蛹1材料和方法1.1蘋果的養(yǎng)殖供試桃小于2017年7月采自洛陽市孟津縣蘋果園，帶回實驗室于人工氣候箱(上海一恒MGC-250P)內(nèi)飼養(yǎng)，飼喂蘋果傳代。設(shè)置（25±1）℃、相對濕度（60±5）%，短光照(12L∶12D)或長光照(14L∶10D)2種光周期條件。1.2滯育的穩(wěn)定性調(diào)查收集不同發(fā)育階段和不同滯育狀態(tài)的蟲體，包括長（短）光照幼齡到初脫果幼蟲；長（短）光照脫果1～8d蛹和幼蟲。短光照幼蟲脫果1d后結(jié)圓繭，最初10d在圓繭里比較活躍，人為破壞繭壁完整性之后幼蟲很快從繭中爬出；10d后幼蟲進(jìn)入低活躍狀態(tài)，人為破壞繭壁完整性之后幼蟲不從繭中爬出，處于滯育維持階段；70d以后達(dá)到滯育結(jié)束狀態(tài)，圓繭轉(zhuǎn)移到25℃條件下一段時間后可以出土活動，90d以后出土活動更為集中。因此，實驗中取保存在8℃沙土中的短光照脫果滯育10、40、70、90、120、140及160d滯育圓繭內(nèi)的幼蟲，包含了不同滯育狀態(tài)的蟲體，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。取保存幼蟲置于1.5mL離心管中稱重，脫果老熟幼蟲3頭合并稱重，2齡及3齡桃小幼蟲蟲體每組10～12頭合并稱重。在每支樣品管中按單組蟲重的10倍加入蒸餾水稀釋，使用玻璃研棒快速充分研磨蟲體。超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝，650E)冰浴破碎5min(超聲設(shè)置：50W，每次2s，間隔2s)，渦旋震蕩混勻30s，4℃條件下5000r?min1.3文獻(xiàn)構(gòu)建與測序按照RNAisoPlus(Takara，CodeNo.9108)方法提取樣品總RNA，長光照和短光照條件下脫果老熟幼蟲各3只，3只幼蟲含頭部的前三分之一蟲體分別提取。文庫構(gòu)建與測序由北京百邁客生物科技有限公司協(xié)助完成。RNA質(zhì)檢合格后，使用NEB7530試劑盒(NewEnglandBiolabs，美國)進(jìn)行文庫構(gòu)建，文庫質(zhì)檢(DNA1000assayKit，Agilent，美國)合格后，每個樣品構(gòu)建一個300～500bp片段長度的雙端(Paired-end，PE)測序文庫，合格的cDNA文庫用IlluminaHiseq4000進(jìn)行高通量測序。經(jīng)原始數(shù)據(jù)測序質(zhì)控，基于基因組注釋的定量質(zhì)控、基因分析、表達(dá)量統(tǒng)計等步驟1.4qpcr驗證試驗根據(jù)2種光照條件下脫果老熟幼蟲差異表達(dá)基因的功能注釋信息，結(jié)合已有相關(guān)文獻(xiàn)報道，篩選與保幼激素合成代謝關(guān)系較密切的功能基因，進(jìn)行熒光定量PCR(qPCR)驗證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的可靠性。使用1.2的方法采集樣品(每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù))，制備qPCR驗證試驗樣品。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挑選出7個保幼激素合成代謝表達(dá)差異基因，分別為保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶(JuvenilehormoneacidO-methyltransferase，2u3000的結(jié)果和分析2.1光照和長光照條件對幼蟲生長過程的影響桃小在短光照和長光照條件下分別進(jìn)行的是滯育和非滯育發(fā)育過程。短光照和長光照條件下，2種光周期下幼蟲生長過程JH滴度沒有差異，JH滴度均是從幼齡到5齡脫果每齡逐漸降低，從2齡到脫果逐漸降低，均在脫果時達(dá)到最低，分別為1.261ng?g2.2差異表達(dá)基因的篩選采用IlluminaHiSeqTM4000高通量測序平臺共獲得44.35Gb(GenBank登錄號:PRJNA495711)有效轉(zhuǎn)錄組(去除接頭序列、質(zhì)量差的序列等)數(shù)據(jù)。將獲得的unigenes序列用BLASTX程序與COG，GO，KEGG，KOG，Pfam，Swiss-proteggNOG和Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，得到桃小短光照老熟幼蟲轉(zhuǎn)錄組unigene的功能信息。在組裝獲得的56723條unigenes中成功注釋27180條，所占比例為47.92%；COG數(shù)據(jù)庫注釋6958條unigenes，占總體的25.60%，比例最高；GO數(shù)據(jù)庫注釋6755條unigenes，占總體的24.85%，比例最高；KEGG數(shù)據(jù)庫注釋10951條unigenes，占總體的40.29%，比例最高；Pfam數(shù)據(jù)庫注釋18301條unigenes，占總體的67.33%；Swiss-prot數(shù)據(jù)庫注釋12565條unigenes，占總體的46.23%；eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋24961條unigenes，占91.84%，比例最高；Nr數(shù)據(jù)庫成功注釋24009條unigenes，占88.33%。檢測短光照和長光照條件下脫果老熟幼蟲差異表達(dá)基因時，采用DESeq2進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，采用了FDR(FalseDiscoveryRate)作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，將FDR小于0.01且差異倍數(shù)FC(FoldChange)大于等于2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。短光照條件下脫果老熟幼蟲下調(diào)基因442個，上調(diào)基因551個，51625個基因表達(dá)沒有明顯變化(圖2)。根據(jù)已有unigenes的功能注釋結(jié)果，分析基因差異表達(dá)的模式。短光照飼養(yǎng)條件下脫果老熟幼蟲表達(dá)下調(diào)基因(圖3A)較多屬于E類(氨基酸運(yùn)輸與代謝)，G類(碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝)，I類(脂類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝)，K類(轉(zhuǎn)錄功能)，L類(修復(fù)、重組和修復(fù))，M類(細(xì)胞凋亡)，O類(翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)及蛋白伴侶)，Q類(次生物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和催化)，R類(具有一般功能)。短光照飼養(yǎng)條件下脫果老熟幼蟲頭部上調(diào)基因(圖2B)較多屬于V類(保護(hù)機(jī)制功能)，Q類(次生物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和催化)，I類(脂類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝)，H類(同工酶運(yùn)輸和代謝)。2.3差異表達(dá)基因qpcr驗證比較短光照和長光照飼養(yǎng)條件下脫果老熟幼蟲發(fā)現(xiàn)，2個相同蟲態(tài)存在993個差異表達(dá)基因，包括7個保幼激素合成代謝相關(guān)的基因。其中6下個調(diào)，1個上調(diào)(表2)。對這7個差異表達(dá)基因進(jìn)行了qPCR驗證，驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)論一致。試驗結(jié)果表明，3桃小中jh合成代謝差異表達(dá)基因的篩選研究表明JH在不同幼蟲滯育中作用并不完全相同。在西南玉米螟(本研究對長光照和短光照條件下桃小老熟幼蟲包含頭部1/3蟲體的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序，獲得桃小的轉(zhuǎn)錄組信息。經(jīng)過測序質(zhì)量控制，所有試驗樣本高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(Q30)均高于92.77%，共得到44.35Gb的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。所有轉(zhuǎn)錄組測序獲得的reads組裝后，獲取56723個unigenes，平均長度963.07bp，而且大部分unigenes能比對到親緣關(guān)系較近的物種，說明測序組裝質(zhì)量較好，我們的試驗為研究桃小提供了基因組數(shù)據(jù)參考。昆蟲的滯育主要是通過生理生化變化，生成小分子抗凍物質(zhì)，進(jìn)而增加細(xì)胞膜及蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、降低滲透壓、降低結(jié)冰點，從而保護(hù)了昆蟲免于受到冷凍低溫的傷害昆蟲的生長發(fā)育以及變態(tài)受到JH的嚴(yán)密調(diào)控，JH先由咽側(cè)體合成并分泌，在咽側(cè)體中JHAMT是合成JH的關(guān)鍵酶JH是一類疏水性激素，必須在血淋巴中依靠載體蛋白JHBP的運(yùn)輸作用才能在靶器官或靶細(xì)胞發(fā)揮功能本研究發(fā)現(xiàn)桃小的JH滴度變化趨勢跟歐洲玉米螟有些類似，滯育早期時含量高，但隨后在剩余的整個滯育期內(nèi)含量下降，并保持持續(xù)的