蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（食品生物化學(xué)課件）

模塊三蛋白質(zhì)與食品加工任務(wù)二蛋白質(zhì)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)Ⅰ.蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)Ⅱ.蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)任務(wù)二蛋白質(zhì)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式。2．了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3．學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。Ⅰ.蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)二、實(shí)驗(yàn)方法（一）雙縮脲反應(yīng)1.原理尿素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。反應(yīng)式如下雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)所有。含有一個肽鍵和一個—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基團(tuán)

NH2NH2

以及乙二酰二胺（O＝C——C＝O）等物質(zhì)也有此反應(yīng)。NH3也干擾此反應(yīng)，因?yàn)镹H3與Cu2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。2.試劑①尿素 ②10%氫氧化鈉溶液③1%硫酸銅溶液 ④2%卵清蛋白溶液3.操作

取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1ml，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml和10%氫氧化鈉溶液約2ml，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。（二）茚三酮反應(yīng)1．原理除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α－氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。β－丙氨酸、氨和許多一級胺都呈陽性反應(yīng)。尿素、馬尿酸、二酮吡唪和肽鍵上的亞氨基不呈現(xiàn)此反應(yīng)。因此，雖然蛋白質(zhì)和氨基酸均有茚三酮反應(yīng)，但能與茚三酮呈陽性反應(yīng)的不一定就是蛋白質(zhì)或氨基酸。在定性、定量測定中，應(yīng)嚴(yán)防干擾物存在。該反應(yīng)十分靈敏，1∶1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測定方法。茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。反應(yīng)機(jī)理如下

此反應(yīng)的適宜pH為5~7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。2.試劑

①蛋白質(zhì)溶液

2%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）②0.5%甘氨酸溶液③0.1%茚三酮水溶液④0.1%茚三酮－乙醇溶液3.操作①取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1~2分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。②在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。（三）黃色反應(yīng)1.原理含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。硝基酚(黃色)鄰硝醌酸鈉(橙黃色)

多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。反應(yīng)式如下2.試劑①雞蛋清溶液將新鮮雞蛋的蛋清與水按1∶20混勻，然后用6層紗布過濾。②頭發(fā) ③指甲④0.5%苯酚溶液 ⑤濃硝酸⑥0.3%色氨酸溶液 ⑦0.3%酪氨酸溶液⑧10%氫氧化鈉溶液3.操作向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。管號123456材料（滴）雞蛋清溶液4ml指甲少許頭發(fā)少許0.5%苯酚4ml0.3%色氨酸4ml0.3%酪氨酸4ml濃硝（滴）24040444現(xiàn)象（四）醋酸鉛反應(yīng)1.原理蛋白質(zhì)分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿條件下，可分解形成硫化鈉。硫化鈉和醋酸鉛反應(yīng)生成黑色的硫化鉛沉淀。若加入濃鹽酸，就生成有臭味的硫化氫氣體。

R-SH+2NaOHR-OH+Na2S+H2O

Na2S+Pb+2PbS+2Na+

PbS+2HClPbCl2+H2S2.試劑1）蛋白質(zhì)溶液50毫升雞蛋清:水=1:12）0.3%半胱氨酸溶液5毫升3）10%氫氧化鈉溶液100毫升4）濃鹽酸100毫升5）0.5%醋酸鉛溶液50毫升6）醋酸鉛試紙：用10%醋酸鉛水溶液浸泡濾紙后晾干3.操作方法

向試管中加入0.5%醋酸鉛溶液1毫升,再加10%氫氧化鈉至產(chǎn)生的沉淀完全溶解為止，搖勻，加入水稀釋一倍的雞蛋清0.4毫升，混勻,小心加熱,到溶液變黑后,加入濃鹽酸數(shù)滴,嗅其味,并將濕潤醋酸鉛試紙置于管口,觀察其顏色的變化。Ⅱ.蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。2、了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。二、實(shí)驗(yàn)原理沉淀反應(yīng)：在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋怼５鞍踪|(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。（1）可逆的沉淀的反應(yīng)此時蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。（2）不可逆沉淀反應(yīng)此時蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水膠體顆粒的因素蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)的變性變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等。三、器材及試劑1.蛋白質(zhì)溶液

5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋清∶水=1∶9）2.pH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液（兩試劑等物質(zhì)的量混合即可） 3.3%硝酸銀溶液4.5%三氯乙酸溶液 5.95%乙醇6.飽和硫酸銨溶液 7.硫酸銨結(jié)晶粉末8.0.1mol·L-1鹽酸溶液 9.0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液10.0.05mol·L-1碳酸鈉溶液 11.0.1mol·L-1醋酸溶液12.0.5%甲基紅溶液 13.2%氯化鋇溶液四、操作步驟

1.蛋白質(zhì)的鹽析無機(jī)鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程。加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過濾，向?yàn)V液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。2.重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1~2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？3.生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。4.有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入2ml蛋白質(zhì)溶液，再加入2ml95%乙醇?；靹?，觀察沉淀的生成。乙醇引起的變性與沉淀取3支試管，編號。依下表順序加入試劑。實(shí)驗(yàn)操作順序表

試劑（ml）管號5%卵清蛋白溶液0.1mol/L氫氧化鈉溶液5%三氯乙酸95%乙醇pH4.7緩沖溶液123111—1———11111——振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向