納米藥物載體入胞及轉運課件

納米藥物載體入胞及轉運——載體設計的機遇與挑戰(zhàn)SeminarII學生：張德蒙導師：馬小軍研究員劉袖洞教授2012.12.13納米藥物載體入胞及轉運SeminarII學生：張德蒙導師：1主要內(nèi)容四展望一背景介紹二納米藥物入胞三納米藥物胞內(nèi)轉運主要內(nèi)容四展望一背景介紹二納米藥物入胞三納米藥物胞2一背景介紹1納米藥物尺寸：1-1000nm納米藥物納米囊膠束無機納米聚合物脂質體組成：載體+藥物穩(wěn)定性差彌補裸藥缺陷靶向傳遞穿透生理屏障基因藥物口服蛋白藥物環(huán)孢菌素A紫杉醇難溶難滲藥物緩、控釋靜脈給藥一背景介紹1納米藥物尺寸：1-1000nm納米納米囊膠束32納米藥物傳遞系統(tǒng)納米藥物傳遞系統(tǒng)：控制藥物釋放時間及位點靶向傳遞一背景介紹時間：載體穩(wěn)定性及與載體與藥物結合緊密程度位點：載體胞外及胞內(nèi)傳遞過程組織器官細胞亞細胞分子緩控釋增強藥效降低毒副作用入胞及胞內(nèi)轉運穿透生理屏障靶向傳遞的不同層次彌補裸藥缺陷胞內(nèi)釋放2納米藥物傳遞系統(tǒng)納米藥物傳遞系統(tǒng)：控制藥物釋放時間及位點4一背景介紹胞外傳遞RES、血管、胞外基質細胞傳遞A.T.Florence,JournalofControlledRelease,2012,164,115–1242納米藥物傳遞系統(tǒng)聚集、擴散、流體力學特性細胞膜：內(nèi)吞胞內(nèi)轉運、釋放細胞內(nèi)吞、轉運機制研究不斷完善，進步與爭議并存納米藥物內(nèi)吞、轉運研究滯后一背景介紹胞外傳遞RES、血管、胞外基質細胞傳遞A.T.5二納米藥物入胞1內(nèi)吞機制RuthDuncan,Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402清除細胞碎片、免疫監(jiān)視細胞間/胞內(nèi)細胞通訊、神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)細胞表面受體及轉運蛋白密度重塑細胞外環(huán)境細胞信號轉導masterorganizer吞噬Celleating胞飲Celldrinking二納米藥物入胞1內(nèi)吞機制RuthDuncan,Mol6納米材料聚集體調(diào)理素作用后的納米粒1內(nèi)吞機制(1)吞噬吞噬細胞(巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞)：血液清除纖維母細胞、內(nèi)皮細胞(200nm-μm)細胞種類作用對象影響因素細胞種類納米材料性質Carreno-GomezB.,DuncanR.,Int.J.Pharm.1997,148,231?240RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402Militello,R.D.etal.Int.J.Pharm.1997,148,231?240B16-F10吞噬殼聚糖微球納米材料聚集體1內(nèi)吞機制(1)吞噬吞噬細胞(巨噬細胞、單77.5μm納米材料性質對胞吞的影響尺寸與形狀表面性質200nm~μm，非關鍵與接觸狀態(tài)有關，研究較少1內(nèi)吞機制(1)吞噬與調(diào)理素作用：親疏水性、表面電荷與細胞作用：表面電荷、親疏水性J.A.Champion,S.Mitragotri,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2006,103,4930–4934MilitelloR.D.,ColomboM.I.,Curr.Mol.Med.2011,11,197?203肺泡巨噬細胞與聚苯乙烯微球電荷密度調(diào)理素作用疏水性負電荷>正電荷表面帶電材料胞吞效率高于中性；疏水>親水7.5μm納米材料性質對胞吞的影響尺寸與形狀表面性質200n8網(wǎng)格蛋白介導內(nèi)吞(CME)表面受體：LDLR、EGFR、TfR、Lectins配體修飾的納米粒及病毒顆粒非特異性的電荷、親疏水性作用引發(fā)胞吞效率較受體依賴型低1內(nèi)吞機制(2)胞飲最基本胞吞方式研究最為透徹動力蛋白依賴150nm100nm受體介導的CME非受體介導的CME：液相胞吞RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402Herve’Hillaireau,PatrickCouvreur.Cell.Mol.LifeSci.2009,66,2873–2896網(wǎng)格蛋白介導內(nèi)吞(CME)表面受體：LDLR、EGFR、Tf9小窩蛋白排列瓶狀膜結構，50-80nm膜區(qū)富含膽固醇和鞘磷脂上皮細胞含量最為豐富(10-20%)，平滑肌細胞、成纖維細胞含量同樣豐富。CvME胞吞速度比CME慢得多配體介導：葉酸、白蛋白、膽固醇巨胞飲肌動蛋白驅動伸展的膜直接落回膜表面,1μm~5μm未發(fā)現(xiàn)配體-受體選擇性參與納米藥物內(nèi)化小窩介導內(nèi)吞(CvME)1內(nèi)吞機制(2)胞飲RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402Herve’Hillaireau,PatrickCouvreur.Cell.Mol.LifeSci.2009,66,2873–2896小窩蛋白排列瓶狀膜結構，50-80nm巨胞飲肌動蛋白驅動小窩10納米藥物傳遞的影響研究仍處于很初級的階段其他內(nèi)吞方式1內(nèi)吞機制(2)胞飲非網(wǎng)格蛋白/小窩蛋白依賴內(nèi)吞方式脂筏結構蛋白依賴的內(nèi)吞與小窩介導內(nèi)吞機理類似，40-50nmClathrin-independentcarrier/GPI-AP-enrichedearlyendosomalcompartmentInterleukin2receptorbpathway,orRhoA-dependentuptakeRuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402Tore-GeirIversen,etal.NanoToday,2011,6,176—185納米藥物傳遞的影響研究仍處于很初級的階段其他內(nèi)吞方式1內(nèi)吞11肌動蛋白、微管蛋白二納米藥物入胞2內(nèi)吞機制定量M.Koivusalo,C.Welch,etal.J.CellBiol.2010,188,547—563L.Pelkmans,D.Puntener,etal.Science,2002,296,535—539H.Y.Nametal.JournalofControlledRelease135(2009)259–267判斷納米藥物入胞的途徑：胞吞抑制劑內(nèi)吞機制非獨立內(nèi)吞轉運有關的分子包被蛋白、銜接子、分離蛋白，RabGTP酶（60多種）內(nèi)吞轉運依賴的細胞骨架抑制劑非專一性繼續(xù)努力藥物受抑制內(nèi)吞通路簡單原理阿米洛利(Amiloride,或EIPA/HOE-694)巨胞飲降低膜表面pH阻斷Rac1/Cdc42信號傳遞細胞松弛素D(CytochalasinD)actin聚合抑制劑氯丙嗪(Chlorpromazine)CMERhoGTPase抑制劑DynasoreCME、吞噬作用、小窩胞吞等動力蛋白依賴機制動力蛋白抑制劑菲律賓素(Filipin)、Nystatin、LovostatinCvME、脂筏胞吞等于膽固醇相關入胞機制與膽固醇作用或干擾其代謝染料木素(Genistein)CvME酪氨酸激酶抑制劑，阻斷小窩形成Cy5.5-疏水性修飾乙二醇殼聚糖納米粒(HGC)CMECvMEMPT肌動蛋白、微管蛋白二納米藥物入胞2內(nèi)吞機制定量M.Ko12二納米藥物入胞細胞方面極性細胞：基底端與頂端胞吞機制不同細胞種類：影響最大細胞狀態(tài)：密度、細胞周期、代謝及胞外基質的變化3內(nèi)吞過程影響因素內(nèi)吞相關物質種類繁多，信號轉導通路復雜ZaunerW,FarrowNA,HainesAMR,JControlRelease,2001,71,39-51不同細胞、不同狀態(tài)對不同粒徑納米粒胞吞結果二納米藥物入胞細胞方面極性細胞：基底端與頂端胞吞機制不同細13形狀：研究處于初級階段，影響因素較多且難以區(qū)分尺寸與形狀聚苯乙烯顆粒胞飲200nm吞噬、巨胞飲StephanieE.A.Gratton,etal.,BioconjugateChem.,2010,21,797-8023內(nèi)吞過程影響因素納米載體方面形狀：研究處于初級階段，影響因素較多且難以區(qū)分尺寸與形狀聚苯14載體表面性質與負電性細胞膜作用，荷正電粒子更易與細胞膜吸附并完成內(nèi)吞電位10~25mV，但并不絕對。Harush-FrenkelO,DebottonN,BiochemBiophysResCommun,2007,353,26-32ZhangLW,Monteiro-RiviereNA,ToxicologicalSciences,2009,110,138-155HeLaPEG-PLAE.Garcia-Garciaetal.,CMLS,Cell.Mol.LifeSci.2005,62,1400-1408表面修飾PEG，增強胞吞(受體作用，提高血液循環(huán)時間)3內(nèi)吞過程影響因素表面電荷親疏水性：靶向配基HeeDongHan,etal.,ClinCancerRes,2010,16,3910-3922小分子(葉酸)、蛋白(Tr)、CPP(RGD)靶向配體密度不可控、腫瘤細胞異質性受體內(nèi)化率低、受體表達下調(diào)臨床效果有限QD655QD655-NH2QD655-COOH2nM20nM人腎胚胎(HEK)細胞載體表面性質與負電性細胞膜作用，荷正電粒子更易與細胞膜吸附并153內(nèi)吞過程影響因素納米藥物主動靶向I.K.Kwonetal.JournalofControlledRelease,2012,164,108–114D.B.Kirpotin,etal,CancerRes,2006,66,6732–6740小鼠腫瘤中脂質體變化細胞實驗anti-HER2Cetuximab、trastuzumab、EC0489、EC0145

療效改善源于EPR效應的被動靶向或局部給藥體外:藥物-細胞無障礙藥物高濃度細胞受體表達穩(wěn)定體內(nèi)：？RES系統(tǒng)靶向：17%達到肝臟其他部位靶向：藥物累積<0.01%HPMAcopolymer?doxorubicin?galactose唾液酸糖蛋白受體3內(nèi)吞過程影響因素納米藥物主動靶向I.K.Kwonet16M.deSmet,etal.J.Control.Release,2011,150102–110I.K.Kwonetal.JournalofControlledRelease,2012,164,108–114RES(脾、肝、肺)捕獲無動力，自由擴散血液中藥物釋放主動靶向？平面細胞與體內(nèi)細胞受體表達差異？時間&密度受體飽和與循環(huán)時間差異？細胞外基質等細胞外環(huán)境變化？3內(nèi)吞過程影響因素納米藥物主動靶向血液循環(huán)PEG修飾：長循環(huán)？24h僅剩10%靶向修飾脂質體血液藥物釋放細胞層緊密程度對藥物擴散的影響M.deSmet,etal.J.Control.17三納米藥物胞內(nèi)轉運轉運過程由入胞方?jīng)Q定，胞吞物或經(jīng)轉運過程重新排出胞外，或進入溶酶體消化降解1納米藥物胞內(nèi)轉運路徑Tore-GeirIversen,etal.NanoToday,2011,6,176—185P.Gonnordetal.SeminarsinCell&DevelopmentalBiology,2012,23,154-164三納米藥物胞內(nèi)轉運轉運過程由入胞方?jīng)Q定，胞吞物或經(jīng)轉運過程18早期內(nèi)體(EE)約5min到達，pH6.5胞吞物與受體分離材料分選：循環(huán)或者代謝通路內(nèi)含蛋白與循環(huán)受體Rab5EarlyEndosomalAntigen1(EEA1)Transferrinreceptor(TfR)循環(huán)內(nèi)體(RE)約30min到達，30-60min內(nèi)循環(huán)至細胞質膜包含循環(huán)材料的網(wǎng)狀結構Rab11Transferrinreceptor(TfR)晚期內(nèi)體(LE)60min后到達，pH6.0甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)介導高爾基體分泌的溶酶體小泡不斷融合含有高度糖基化的溶酶體膜相關蛋白(LAMPs)含有內(nèi)在膜，多泡體M6PRRab7LAMPs1-3Rab7溶酶體(LYS)pH4.5-5.5與胞吞物降解及細胞自噬密切相關，包含60多種溶酶體酶LAMPs組織蛋白酶D(cathepsinD)細胞器特征Marker2參與轉運的主要細胞器三納米藥物胞內(nèi)轉運RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402早期內(nèi)體(EE)約5min到達，pH6.5Rab5Early19P.Gonnordetal.,SeminarsinCell&DevelopmentalBiology,2012,23,154-164三納米藥物胞內(nèi)轉運3轉運過程監(jiān)測方法Q.O.Garred,etal.Traf?c2,2001,2,26-36SternST,etal,Tox.Sci.2008,106,140–152透射電鏡細胞器Marker熒光標記形態(tài)學判斷細胞器位置及形態(tài)細胞間差異較大樣品處理對形態(tài)的影響分辨率限制：高分辨熒光成像技術內(nèi)化標記物動態(tài)移動細胞器Marker非專一性目標熒光與細胞器熒光融合專一高效Marker驗證Au溶菌酶QD豬腎細胞P.Gonnordetal.,Seminars20三納米藥物胞內(nèi)轉運4轉運過程的調(diào)控了解納米藥物轉運機制，尋求實現(xiàn)最佳藥效的的轉運方式內(nèi)吞決定轉運的例外病原體(分支桿菌、沙門氏菌等)擾亂轉運避免進入LYS降解降低免疫識別的可能性內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)復合物泛素化海參毒素、蓖麻毒素多途徑內(nèi)吞，轉運過程相同泛素化標記：降解通路去泛素化標記：循環(huán)通路極性細胞入胞方式相同，轉運路徑不同闡明轉運過程變化機制，有助于納米藥物胞內(nèi)定向傳遞Sandvig,K.,etal.,FEBSLett.,

2010,584,2626?2634三納米藥物胞內(nèi)轉運4轉運過程的調(diào)控了解納米藥物轉運機制，21分子量>1000Da需通過內(nèi)吞細胞穿透肽4轉運過程的調(diào)控納米藥物胞內(nèi)定向傳遞pH響應載體、溶酶體酶降解載體親溶酶體傳遞：細胞質傳遞：親內(nèi)體傳遞：轉胞吞作用pH6.5響應溶酶體融合前釋放或阻斷轉運極性細胞單向轉運——