還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性脂肪肝斑馬魚模型的保肝作用

還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性脂肪肝斑馬魚模型的保肝作用

酒精性肝?。╝ld）是由長(zhǎng)期飲酒引起的肝臟損傷引起的肝臟損傷。在早期階段，它通常表現(xiàn)為酒精性肝炎（ald）和酒精性肝炎，可發(fā)展為肝臟纖維、肝硬化甚至肝功能衰竭。臨床常用皮質(zhì)類固醇、己酮可可堿等治療AFLD，雖能減輕部分臨床癥狀，但毒副作用明顯、療效個(gè)體差異大等因素嚴(yán)重限制了其廣泛使用。有Meta分析顯示，糖皮質(zhì)激素可改善重癥酒精性肝炎患者短期生存率，但對(duì)輕、中型病例無(wú)明顯效果還原性谷胱甘肽片在臨床上主要用于慢性肝臟疾病的輔助治療，包括病毒性、藥物毒性、酒精毒性引起的肝臟損傷。但采用AFLD斑馬魚模型研究還原性谷胱甘肽片的治療效果未見(jiàn)報(bào)道。與嚙齒類動(dòng)物相比，斑馬魚具有飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)、方便，容易獲得足夠的樣本量，胚胎透明、便于顯微鏡下觀察肝臟，有利于高通量藥物篩選等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)1材料表面1.1化學(xué)試劑及試劑還原型谷胱甘肽片，批號(hào)19040870，重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制成20mmol/L母液。陽(yáng)性對(duì)照：RU-21，批號(hào)25780，美國(guó)精神科學(xué)有限公司，陰涼避光保存，用超純水配制成100mg/mL母液，-20℃保存。甲基纖維素（批號(hào)079K0054V,Sigma,USA）；無(wú)水乙醇（批號(hào)20200825，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；4%組織細(xì)胞固定液（批號(hào)20190923,Solarbio）；二甲苯（批號(hào)C10631736，上海麥克林生化科技有限公司）；PBS緩沖液（批號(hào)10C16B30，武漢博士德生物工程有限公司）；Mayer蘇木素染色液（批號(hào)YH0170326）、伊紅染色液（批號(hào)YH180124）、中性樹脂封片劑（批號(hào)YH0170419），均購(gòu)自上海依赫生物科技有限公司；軟蠟（熔點(diǎn)54～56℃，批號(hào)20180108）、硬蠟（熔點(diǎn)62～64℃，批號(hào)20190628），上海華永石蠟有限公司；iTaqUniversalSYBRGreenSupermix（貨號(hào)1725124,Bio-rad,USA);FastQuantRTKit(WithgDNase）試劑盒（貨號(hào)KR106,TIANGEN,China);RNA-QuickPurificationKit(RNA快速提取試劑盒）（貨號(hào)RN001,YiShanBiotech,China）。1.2儀器和檢測(cè)方法解剖顯微鏡（SZX7,OLYMPUS,Japan);CCD相機(jī)（VertA1，上海土森視覺(jué)科技有限公司）；精密電子天平（CP214,OHAUS,USA）；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Nanodrop2000,Thermo,USA);PCR儀（T100,BIO-RAD,USA）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFXConnect,BIO-RAD,USA）；高速冷凍離心機(jī)（PIC017/21,Thermo,USA）。1.3主養(yǎng)試驗(yàn)psf黑色素等位基因突變型（albino）品系斑馬魚，以自然成對(duì)交配方式進(jìn)行繁殖，共1020尾，日齡為受精后5d(5dpf），均飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每升反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為450～550μS/cm;pH值為6.5～8.5；硬度為50～100mg/LCaCO2方法2.1還原型谷胱甘肽片保肝作用基于文獻(xiàn)研究隨機(jī)選取210尾5dpf黑色素等位基因突變型（albino）品系斑馬魚于六孔板中，每孔均30尾，分別水溶給予還原型谷胱甘肽片500、1000、2000、4000、8000μmol/L，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和模型組，每孔體積3mL。除對(duì)照組外，其余組均給藥同時(shí)用2%乙醇誘導(dǎo)斑馬魚32h建立AFLD模型，觀察記錄斑馬魚的死亡情況及表型，確定還原型谷胱甘肽片對(duì)AFLD模型斑馬魚的MTC。2.2陽(yáng)性對(duì)照藥隨機(jī)選取180尾5dpf黑色素等位基因突變型（albino）品系斑馬魚于六孔板中，每孔30尾。分別水溶給予還原型谷胱甘肽片500、1000、2000μmol/L，陽(yáng)性對(duì)照藥RU-21100μg/mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和模型組，每孔體積3mL。除對(duì)照組外，其余實(shí)驗(yàn)組均用2%無(wú)水乙醇誘導(dǎo)斑馬魚建立AFLD模型，28℃處理32h后，用油紅O進(jìn)行染色，染色后每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，使用NIS-ElementsD3.20高級(jí)圖像處理軟件分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚肝臟脂肪染色強(qiáng)度（S），保肝功效計(jì)算公式如下：2.3還原型谷胱甘肽片對(duì)斑馬魚肝臟組織病理學(xué)的影響斑馬魚給藥及造模同“2.2”項(xiàng)，用4%組織細(xì)胞固定液固定斑馬魚，進(jìn)行HE染色（固定-脫水-包埋-切片-染色），并進(jìn)行病理學(xué)分析評(píng)價(jià)還原型谷胱甘肽片保肝功效。2.4斑馬魚afld活性的檢測(cè)隨機(jī)選取450尾5dpf黑色素等位基因突變型（albino）品系斑馬魚于六孔板中，每孔30尾。分別水溶給予還原型谷胱甘肽片500、1000、2000μmol/L，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和模型組，每孔體積3mL，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。除對(duì)照組外，其余組均用2%無(wú)水乙醇誘導(dǎo)斑馬魚建立AFLD模型，28℃處理32h后，收集各組斑馬魚樣本，使用RNA快速提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR）試劑盒檢測(cè)β-actin、IL-6、HMGB-1b和TNF-α基因的表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。2.5統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)用3結(jié)果3.1模型組與模型組狀態(tài)的比較還原型谷胱甘肽片在500～2000μmol/L濃度時(shí)，均未引起斑馬魚死亡，且與模型組狀態(tài)相似。在4000μmol/L時(shí)誘發(fā)76.7%(23/30尾）斑馬魚死亡，在8000μmol/L時(shí)誘發(fā)100.0%(30/30尾）斑馬魚死亡。故確定還原型谷胱甘肽片對(duì)AFLD模型斑馬魚的MTC為2000μmol/L。見(jiàn)表2。3.2還原型谷胱甘肽片保肝功效與對(duì)照組比較，模型組S顯著增加（P<0.001）；與模型組比較，還原型谷胱甘肽片1000、2000μmol/L組和RU-21組S顯著降低（P<0.01、0.001）。還原型谷胱甘肽片500、1000、2000μmol/L組保肝功效分別為14%、32%、71%;RU-21100μg/mL組保肝功效為48%。還原型谷胱甘肽片在1000、2000μmol/L濃度具有保肝功效。結(jié)果見(jiàn)表3和圖1。3.3病理組織學(xué)檢測(cè)細(xì)胞空泡對(duì)照組斑馬魚肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，邊緣清晰，肝細(xì)胞核規(guī)則清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富且無(wú)脂肪空泡；模型組肝細(xì)胞排列松散，細(xì)胞核間距大，細(xì)胞質(zhì)溶解有較多的脂肪空泡（箭頭所指為肝細(xì)胞空泡）。陽(yáng)性對(duì)照藥RU-21100μg/mL和還原型谷胱甘肽片2000μmol/L組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，脂肪空泡較模型組減少，與對(duì)照組較為相似，具有明顯的保肝功效。還原型谷胱甘肽片500、1000μmol/L組肝細(xì)胞排列松散，且有較多脂肪空泡，與模型組較為相似，保肝功效均不明顯。結(jié)果見(jiàn)圖2。3.4還原型谷胱甘肽片降低il-6、hgmb-1和tnf-mrna表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組IL-6、HMGB-1b和TNF-αmRNA表達(dá)顯著增加（P<0.05、0.01）；與模型組比較，還原型谷胱甘肽片500、1000、2000μmol/L組IL-6、HMGB-1b和TNF-αmRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01、0.001）。結(jié)果見(jiàn)表4。4還原型谷胱甘肽片保肝作用的機(jī)制保肝藥大多數(shù)為降脂藥物，其作用機(jī)制為減少肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，但多數(shù)降脂藥在肝臟中代謝，且可能驅(qū)使血脂更集中于肝臟代謝，加重肝臟負(fù)擔(dān)，使脂質(zhì)蓄積進(jìn)而損害肝功能在人類細(xì)胞中谷胱甘肽是一種自然合成的三肽，也是一種非酶性的抗氧化劑，并且這種抗氧化劑也是通過(guò)細(xì)胞合成的還原型谷胱甘肽片改善AFLD模型斑馬魚肝臟脂肪水平，改善肝臟組織病病變，具有明顯的保肝功效，其主要機(jī)制可能與明顯下調(diào)IL-6、HMGB-1b和TNF-α等炎癥基因有關(guān)。TNF-α屬于炎性介質(zhì)，可對(duì)炎癥反應(yīng)中的生理病理過(guò)程進(jìn)行干預(yù)介